175173. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ergot alkaloid-származékok előállítására
3 175173 4 I. Táblázat ct-adrenerg-blokkoló hatás Vegyület IC; In vitro (a) s o mcg/ml In vivo (b) EDS0 mg/kgi.v. LD5 o (egér) Id mg/kg i.v. Ergotami 0,07 0,2 70 5’-debenzil-5 p-klórbenzilergotamin 5. 0,03 0,1 100 Dihidroergot amin 0,02 0,08 118 5 ’-debenzil-5’-p-klórbenzil-dihidroergotamin 0,02 0,05 150 Dihidroergokrisztin 0,05 0,03 174 5’debenzil-5 ’-pklórbenzil-dihidroergokrisztin 0,03 0,02 190 (a) az a-receptor-blokkoló aktivitást az epinefrin görcsokozó hatásával szemben határoztuk meg izolált tengeri malac-ondóhólyagon Brügge J. módszere szerint (Helv. Physiol. Acta 3, 117, 1945). Az 50 %-os gátlást okozó hatóanyagkonoentrációt grafikusan állapítottuk meg mindegyik antagonistára. (b) az a-receptor-blokkoló hatást patkányoknál határoztuk meg Luduena F.P. és mtsai. módszere szerint (Arch. Int. Pharmacodyn. CXXII, 111, 1959). ED5 o az antigonista grafikusan meghatározott adagja, amely az állatok 50%-os védelmét biztosítja 0,2 mg/kg epinefrin i. v. beadása esetén 5 perc után. (c) LD50 értékét egereken határoztuk meg szabványos műszerrel. Az I. táblázatból látható, hogy a három új származék, az alapvegyületekkel összehasonlítva, megnövekedett a-adrenerg hatást tanúsít mind in vitro, mind pedig in vivo kísérleteknél. Másrészt az akut-toxicitás is jelentősen csökken. Ismeretes, hogy az (I) általános képletű ergot-alkaloidok olyan lizergsavamidok, amelyek három aminosav megfelelő kondenzációjából bioszintetikus úton leszármaztatott ciklopeptidrészt tartalmaznak és amelyek egyike, például a prolin, valamennyiben jelen van. A ciklol-maradék az ergotamin esetében (Rj = -CH3; R2 = -CH2C6Hs) egy molekula fenilalanin és egy molekula a-hidroxialanin; az ergokrisztin esetében (R, = -CH(CH3)2; R2 = -CH2C6Hs) egy molekula fenilalanin és egy molekula a-hidroxivalin; az ergokriptin esetében pedig (R, = —CH(CH3)2; R2 = -CH2CH(CH3)2) egy molekula leudn és egy molekula a-hidroxivalin. Meglepő módon azt találtuk, hogy a mutagén szenei előzőleg kezelt és nem hidroxilezett aminosavak (például fenilalanin vagy leucin) távollétében növekedésre alkalmatlanná tett Claviceps purpurea törzsek alkalmasak olyan alkaloidok és analógjaik termelésére, amelyek terminális aminosavakként a közegben jelenlévő analógot tartalmazzák akkor, ha annak az aminosavnak a jelenlétében növekedtek, amelytől ezeket mutagén módon függővé tettük. Lehetőség nyílik az aminosavanalógot tartalmazó alkaloidok nagy hozammal való termelésére olymódon, hogy a törzs által megkívánt aminosav kis mennyiségét adjuk a fermentáció első fázisába, amely „tropofázis,> néven ismert, és ezt követően az analóg nagyobb mennyiségét visszük a fermentáció második fázisába, amely „idiofázis”-ként ismert. Az alkalmazott törzsek az ergot-alkaloidok jól ismert termelői alámerített tenyészetben, amelyeket néhány szerző már leírt (Spalla C., Genetic of Ind. Microorganismus, Academia Praque 1973, 393,1973; Floss H. G. és mtsai., Phytochemistry, 8. kötet, 141, 1974). A használható törzsek a Claviceps purpurea ATCC 15383, amely ergotamin-termelő törzs, és a 3,276.972 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás ismerteti; a Claviceps purpurea ATCC 20103, amely ergodsztin-termelő törzs és a 3,567.583 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban van leírva, és a Claviceps purpurea ATCC 20019, amely ergokriptin-termelő törzs és a 3,485.722 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás ismerteti. Az ergotamin, az ergokrisztin vagy az ergokriptin vegyületeket termelő törzsek ferde tenyészetből származó micéliumszövevényét steril vízben szuszpendáljuk és nagyon apró részekre tőrjük szét Warint-keverőben, majd selyemszitán átszűrjük. A szűrletet, amely csaknem egysejtű töredékeket tartalmaz, UV sugárzásnak tesszük ki annak érdekében, hogy 90-99%-os pusztulást érjünk el. A szuszpenziót steril vízzel hígítjuk, Petri-csészékben szilárd közegre terítjük és hozzáadjuk azt az aminosavat, amelyhez a kívánt mutánsokat kiválasztottuk (például leucint vagy fenilalanint). Megfelelő inkubációs idő után a megnövekedett kolóniákat jól ismert módon átvisszük olyan közegbe, amely nem tartalmaz olyan aminosavat, amelyhez a kívánt mutánsokat kiválasztottuk. Azok a törzsek, amelyek képesek növekedni az előző közegben és nem képesek növekedni az utóbbiban, az aminosavtól függenek. Ezeket az ezt követő átvitel után az aminosavat tartalmazó közegben tartjuk. Az alkaloid-analógok termeléséhez a kívánt mutánsok folyékony közegben tenyésznek, amely szénforrást, nitrogénforrást, foszforforrást, kénforrást és bizonyos ásványi sókat tartalmaz, valamint azt az aminosavat foglalja magában, amelyet a törzs kíván. Az aminosav mennyisége 0,5 g/1 és 2 g/1 között változik ezektől függően. Mintegy 3-5 napos inkubációs idő után a tenyészethez a törzs által megkívánt analóg aminosavat adjuk 3-6g/l mennyiségben és 9-11 napig tovább inkubáljuk, de az összes inkubációs idő 14 napot nem haladhat meg. A tenyésztést, amelyet fermentációnak is nevezünk, rázóedényben vagy különböző méretű fermentorokban végezhetjük. A fermentáció végén a táptalajkultúrák az analóg alkaloidot és kis mennyiségű normál alkaloidot tartalmaznak. Az alkaloid-analógot a következő módon extraháljuk: 5 I 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
