175142. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nyújtott hatású csekély antigénhatással rendelkező inzulin-készítmény előállítására
11 175142 12 1. Hagyományos NPH szarvasmarha-inzulin, amely a leírásban említett szennyezéseket tartalmazó, átkristályosított szarvasmarha-inzulinból a szokásos módon készült. 2. Tisztított NPH szarvasmarha-inzulin- amely tisztított kristályos szarvasmarha-inzulinból a szokásos módon készült, azonban a leírásban említett szennyezésektől oszlopkromatográfiával megtisztítottuk. 3. Tisztított NPH szarvasmarha-inzulin, amely a 10 találmány szerinti eljárással, a 3. példában leírtak szerint készült (új NPH szarvasmarha-inzulin). A nyulakba tíznaponként fecskendeztük be szubkután, 20 NE dózisban a vizsgálni kívánt inzulinkészítményt. A hagyományos szarvasmarha-in- 15 zulin adjuvánsok nélküli befecskendezése után jelentősebb mértékű antitestképződést nem lehetett kimutatni, és — tekintettel az összehasonlításra, egy olyan immunizációs eljárást kellett alkalmaznunk, amilyent az antitestek létrehozásánál szoká- 20 sósán használnak. Azaz, legelőször Freud-féle teljes adjuvánsban emulgeált inzulin-injekciót fecskendeztünk be, a későbbiek során pedig Freud-féle csonka adjuvánsban emulgeált inzulint adtunk be. Az inzulin-antitestek képződését 20 naponként 25 vizsgáltuk meg, Ortved-Andersen és munkatársai módszerével [Acta Endocr, 69, 195—208 (1972)]. A vizsgálatok során azt tapasztaltuk, hogy a hagyományos NPH szarvasmarha-inzulinnál bekövetkezett az antitestképződés, (1000—2000 pE/ml) a 30 tisztított NPH szarvasmarha inzulinnál az antitestképződés csökkent mértékű volt (800-1000juE/ml) míg a találmány szerinti eljárással előállított új NPH szarvasmarha-inzulinnál antitestképződést nem lehetett kimutatni. Megjegyezzük, hogy a fenti 2. 35 és 3. számú készítmény tisztítása ugyanazzal a kromatográfiás eljárással történt. Az egyetlen különbség közöttük az volt, hogy a 2. számú készítmény előállításakor az inzulint először elkülönítettük, majd pedig önmagában ismert módon prot- 40 aminnal reagáltattuk, míg a 3. számú készítmény előállításakor az inzulint, előzetes elkülönítés nélkül, reagáltattuk karbamid-tartalmú eluátumban. Egy további kísérletsorozatnál enyhébb immunizációs eljárást alkalmaztunk, kizárva az elölt bak- 45 tóriumokkal történő kezdeti immun-stimulálást. így minden esetben Freud-féle csonka adjuvánsban emulgeált inzulinkészítményt adtunk be az állatoknak, tíznaponként, 20 NE állandó dózisban. Az inzulin antitestek képződését 10 naponként 50 vizsgáltuk, az alábbiakban ismertetett új módszer segítségével. Azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti eljárással előállított új NPH szarvasmarha-inzulin készítménynél antitest képződést nem lehet kimu- 55 tatni. Antitest-meghatározás PEG-ntódszerrel 100/d nyúlszérumot, 100/d 12 51-inzulint (körülbelül 2/iE/ml), 100/il inzulin oldatot (250/ct E/ml és 5 700jul foszfátpuffert (0,04 mól, pH = 7,4, 0,15 mól nátriumkloridot és 0,5% emberi albumint tartalmaz) inkubáltunk 4 °C-on 48 órán át. 500 jd PEG 6000-t adtunk hozzá, és elegyítés után a mintát 1 órán át tartottuk 20 °C-on. 10 percig centrifugáltuk 3000/perc fordulatszámmal, a felülúszót dekantáltuk és elöntöttük, és megmértük a csapadék 125 I-tartalmára jellemző beütésszámot. Mindegyik vizsgálathoz olyan mintát is használtunk, amely feleslegben vett tengerimalac antiszérumot is tartalmazott (a maximális mértékű megkötéshez), továbbá olyan mintát, amely immunizálatlan nyulaktól vett nyúlszérumot tartalmazott (zérus megkötés). Az eredményeket az alábbi képlet segítségével számítottuk ki, a mért megkötést a maximális mértékű megkötés százalékában adva meg: T—T antitest, % =--------2— ioo Tm-T0 ahol T = beütésszám a vizsgálandó mintára T0 ~ beütésszám az O-mintára Tm = beütésszám a maximális mértékű megkötést biztosító mintára A kapott eredmények azt mutatják, hogy amíg a találmány szerinti eljárással tisztított NPH szarvasmarha inzulinnál antitestképződést gyakorlatilag nem tapasztaltunk - a fenti képlettel számított érték 1% körül volt —, addig a másik két vizsgált inzulinnál az antitestképződés a 100%-ot is elérte. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás nyújtott hatású, csekély antigén hatással rendelkező inzulin-készítmény előállítására, tisztított szarvasmarha inzulin és valamely amino-csoportokat tartalmazó szerves bázis, mint protamin vagy poli-L-arginin reakciója útján, azzal jellemezve, hogy a reakciót stabilizátor jelenlétében, 6—9 közötti pH-értékű vizes puffer-oldatban végezzük, és a kapott terméket izoláljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy stabüizátorként karbamidot használunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az izolálást a termék hígítással történő leválasztásával végezzük. A kiadáséit felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 804680 - Zrínyi Nyomda, Budapest 6
