175049. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új BU-2231 jelű glikopeptid-antibiotikum-komplex, az egyes komponensek és származékok előállítására
5 175049 6 Burgonyaszeletes A Leudemann-féle savtűrési teszt burgonyaszeletes tesztben normálisan növekszik, és képez légmicéliumot. 5 Kataláz reakció Pozitív Oxidáz Negatív A termelt A Bu—2231 komplex és antibiotikumok nebramicin faktorok. 10 3. táblázat Az E465—94 jelzésű törzs szénhidráthasznosítása 15 D(—)-arabinóz - D(+)-melibióz -L(+)-arabinóz — trehalóz ++ D-xilóz- raffinóz -D-ribóz + D(+)-melecitóz — 20 L-ramnóz- oldható keményítő ++ D-glükóz ++ cellulóz — D(+)-galaktóz ++ glicerin ++ D-fruktóz ++ inozit — 25 D-mannóz ++ D-mannit — L(-)-szorbóz- D-szorbit -szacharóz ++ dulcit -laktóz ++ szalicin cellobióz — 30 Alapközeg: 0,1% Difco élesztőkivonattal kiegészített Pridham-Gottlieb-féle, ásványi sókat tartalmazó táptalaj. 35 A növesztés hőmérséklete: 37 °C. A sejtfal összetétele A T. Yamaguchi [J. Bacteriol. 89. 444-453 40 (1965)] által leírt módszerrel preparáljuk ki a sejtfalat. A következőképpen végezzük az aminosav analízist: 10 mg tisztított sejtfalanyagot 1 ml 6 normál sósavval 18 órán át zárt csőben 120°C-on melegítünk. Azonos térfogatú desztillált vízzel hí- 45 gítjuk a hidrolizátumot. megszűrjük az oldatot, majd csökkentett nyomáson ledesztilláljuk az oldószert. 0.1 ml desztillált vízben oldjuk a végtermék felét, és kétdimenziós vékonyrétegkromatográfiával vizsgáljuk. 2 ml 2,2-es pH-jú citrát pufferoldatban 50 oldjuk a termék másik felét, és folyadék-kromatográfiával vizsgáljuk. Egy szilikagéles vékonyréteg lemezre (60F2S4, E. Merck AG. Germany) felvisszük a hidrolizátum 5 pl-nyi alikvotját, az egyik irányban fenol és víz 4:1 arányú elegyében, majd az 55 elsőre merőleges irányban n-butanol. ecetsav és víz 3:1:1 arányú elegyében futtatjuk. 0,2%-os etanolos ninhidrin reagensoldattal befújva, majd 5 percig 110 ‘ C-on szárítva hívjuk elő a foltokat. A mezoés/vagy DD-diamino-pimelinsav (DAP) és az LL- 60 -DAP megkülönböztetése céljából egy cellulózporral készült vékonyréteg lemezre visszük fel a hidrolizátum 5 jul-nyi alikvotját. Metanol-víz-10 normál sósav-piridin 80 :17,5 : 2,5 :10 arányú elegyben futtatjuk a lemezt 24 órán át, majd 0,2%-os nin- 65 hidrin reagensoldattal hívjuk elő. Ebben a vékonyrétegkromatográfiás futtatóelegyben az LL-DAP gyorsabban fut, mint az összehasonlító anyagként használt mező—DAP. A sejtfalkészítmény aminosavait aminosav analizátor segítségével ugyancsak meghatároztuk. Az E465-94 jelzésű törzs sejtfalpreparátumában mezo-a, e-diamino-pimelinsavat (mezo-DAP), alanint és glutaminsavat mutattunk ki (4. táblázat). A sejtfalban levő szénhidrátokat a következőképpen határoztuk meg: A nyers sejtfal 50 mg-nyi mintáját 2 ml 2 normál kénsavban oldjuk, és 2 órán át 120°C-on hidrolizáljuk. Telített bárium-hidroxid-oldattal semlegesítjük a hidrolizátumot, kicentrifugáljuk a kivált bárium-szulfátot, és fagyasztva szárítjuk a felülúszó folyadékot. Trimetil-szililezzük az ily módon nyert anyagot, és összehasonlító anyagként különféle cukrokat használva, gázkromatográfiásán vizsgáljuk. Az E465-94 jelzésű törzs sejtfalának szénhidrát analízise ramnóz. mannóz, galaktóz és glükózamin jelenlétét mutatta ki. 4. táblázat A sejtfal aminosav-összetétele DAP Glutamin-Aszpa(izomer) Glicin sav ragin- Alanin sav ++ ± (mező) ++ nyomokban +++ 5. táblázat A sejtfal szénhidrát-összetétele Arabinóz Ramnóz Mannóz Gálák- Glükóz Glükóztóz amin — + ++ ++♦ — 4 + Összehasonlítás más Actinomyces törzsekkel Bleomicin típusú antibiotikumok termelése Az E465-94 jelzésű törzs egy új. Bu-2231 jelzésű antibiotikum-komplexet termel, amely feltehetően új. bleomicin típusú antibiotikumokból áll. Ezért összehasonlítottuk a törzset néhány Actinomyces törzzsel, amelyekről leírták, hogy bleomicint, vagy azzal szerkezeti rokonságban álló antibiotikumokat termelnek. Az eredményeket a 6. táblázatban foglaltuk össze. Az E465—94 jelzésű törzs világosan különbözik ezen mikroorganizmusok bármelyikétől. 6. táblázat Az E465—94 jelzésű törzs összehasonlítása hat. a bleomicin csoportban tartozó antibiotikumot termelő Actinomyces törzzsel 3
