175033. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és eszköz humán korion gonadotropin fokozott termelésével járó rákos megbetegedések kimutatására, valamint terhesség meghatározására
7 175033 8 hozott vizsgálókészletek; valamint a direkt agglutinációs teszt végrehajtására alkalmas vizsgálókészletek, így a Denver Biologicals Co. amerikai egyesült államokbeli cég által „DAP Test” márkanéven vagy a Moher GmbH, NSZK-beli cég által „Gonavislide” márkanéven forgalomba hozott vizsgálókészlet. Még részletesebben, a találmány szerinti eljárás gyakorlati megvalósítása során a vizsgálandó nőtől vett vizelet- vagy vérszérummintát (például 5-50 ml térfogatú mintát) — előnyösen a vizeletminta egy alkalmas szűrőpapíron át végzett szűrése vagy centrifugálás útján történő derítését követően — 10—500-szoros, előnyösen 10—50-szeres koncentrálásnak vetjük alá úgy, hogy a mintát egy olyan ultraszűrő membránnal érintkeztetjük, amelynek molekulasúly szerinti szelektivitása mintegy 10 000 és mintegy 50 000 közötti, előnyösen mintegy 10 000 és mintegy 35 000 közötti. Más szavakkal, célszerűnek találtuk a molekulasúly alsó határaként az 10 000 vagy előnyösen a 15 000 értéket és felső határaként az 50 000, előnyösen 35 000 értéket. A mintát tehát addig szűrjük az ultraszűrő membránon, míg a minta nem szűrt, vagyis visszatartott része eléri a kívánt koncentráltsági fokot, például a visszamaradó rész térfogata 0,1—5,0 ml lesz. A koncentrálást mintegy 0 °C és 40 °C közötti, előnyösen 4 °C és 25 °C közötti hőmérsékleten végezzük. A koncentráláshoz rendszerint 1—2 órára van szükség. A szűrletet kiöntjük, a visszatartott részt pedig a benne levő HCG kimutatása céljából a fentiekben ismertetett kimutatási tesztek valamelyikének vetjük alá. A koncentrált vizelet- vagy vérszérumminta vizes oldatát egy ampullában összekeverjük HCG- vagy 0-HCG-antiszérum, HCG-vel érzékenyített látexrészecskék vagy eritrociták, puffer, konzerválószer és hordozóanyagok liofilizált keverékéből a szokásosan ajánlott mennyiséggel. Miután az így kapott keveréket mintegy 1-2 órán át állni hagytuk, a pozitív reakciót az jelzi, ha egy specifikus szedimentációs sáv jelenik meg az ampulla alján egyértelműen meghatározott gyűrű alakjában, ha az ampulla kör alakú vagy pedig egy folt alakjában, ha az ampullának kúposán kiképzett feneke van; negatív reakciót jelez viszont egy diffúz sárgásbarna üledék. Alternatív módon a koncentrált vizeletminta vizes oldatában levő HCG kimutatására a fentiekben ismertetett látex agglutinációs vagy direkt agglutinációs teszteket is használhatjuk. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja értelmében úgy járunk el, hogy a koncentrátor, azaz az ultraszűrő membránt tartalmazó kamra belső felületét előzetes mosásnak vetjük alá 0,1—5%-os, előnyösen 0,1—1%-os vizes szarvasmarhaszérum-albumin-oldattal (röviden: BSA), a koncentrátor belső felületét mintegy 1 percen át érintkeztetve ezzel a mosófolyadékkal a vizeletmintának a koncentrátorba való töltése előtt. Ez az előzetes mosás ugyanis jobban definiált pozitív és negatív reakciókat biztosít és növeli a találmány szerinti módszer érzékenységét azáltal, hogy gátolja a HCG adszorpcióját az eszköz felületén. Továbbá azt találtuk, hogy ugyanezek az előnyök érhetők el, ha a BSA-t a korábban említett, vizeletvagy vérszérumminta szűrésére használt szűrőpapír mosására használjuk vagy ha a BSA-t közvetlenül a 4 kiinduláskor használt vizeletmintához adjuk olyan mennyiségben, hogy a vizeletben a BSA koncentrációja 0,001 és 1,0%, előnyösen 0,01% és 1,0% közötti legyen. Az előbb említett célokra egyébként a BSA-tól eltérő fehérjék, például az emberi vérszérumból elkülönített albumin, gamma globulin (mind szarvasmarhából, mind emberből elkülönített), mioglobin, fibrinogén, humán hemoglobin és kacsakagyló-hemocianin is használható. Bár szakember számára kézenfekvőnek tűnhet HCG egy híg oldatának olyan mértékű koncentrálása, hogy a HCG koncentrációja azután egy meghatározott teszt érzékenységi tartományába essék, ez a kon centrálás ellentmondásban van a HCG testnedvekben való meghatározására szolgáló immunológiai tesztek kapcsán eddig felhalmozódott tapasztalatokkal. Első közelítésben nyilvánvalónak látszik, hogy olyan test nedvek, mint a vizelet vagy a vérszérum koncentrálási koncentrálja azokat az anyagokat is, amelyek gátolják vagy keresztezik a kívánt immunológiai tesztet. Másodszor, a szakirodalomban egyértelmű kitanítás talál ható arra nézve, hogy a testnedvek, például a vizeiéi koncentrálása növeli a téves pozitív eredmények elő fordulását [lásd például Wide, L.: Acta Endocrinol Suppl., 70, 95. és 100. oldal (1962) és Hobson, M fentiekben már idézett könyvének 43. oldalán]. Közelebbről, Wide egyértelműen azt tanácsolja hogy az immunológiai tesztek beállítását úgy kel végrehajtani, hogy csak akkor kapjunk pozitív ered ményt, ha a HCG koncentrációja a vizeletben legalább 1000 milli nemzetközi egység per milliliter. Máskü lönben szerinte az egyes mintákban előforduló Lí vagy humán menopauzális gonadotropin az adót! koncentrációkban interferálhatnak a HCG-meghatáro zás specifikusságával téves pozitív eredményeket adva Ezt a szituációt kívánta megkerülni Fisk, R. T. amikor a 3 171 783 számú amerikai egyesült államok beli szabadalmi leírásban olyan módszert ismertetett amelynek értelmében a vizeletet kaolinon való adszoi beáltatás útján lehet koncentrálni. Ez a módszer azon ban jóval bonyolultabb, mint a találmány értelmébe! végzett ultraszűrés, hiszen a HCG adszorbeáltatási után az ebben a szabadalmi leírásban ismertetett mód szer értelmében legalább három további lépést kel! végrehajtani, mielőtt egy immunológiai tesztben végrí lehet hajtani a HCG kimutatását. Hasonló, szintéi kaolinon való adszorbeáltatáson alapuló bonyolult technikát ismertettek már korábban Hon, E. H. é1 Morris, J. McL. [Yale J. Bioi. Med., 27,178 (1954)] E két módszer bonyolultságára nézve további bizony! ték az a tény, hogy a gyakorlat emberei, például ai előzőekben említett Hobson vagy Hibbard egyike sen alkalmazta soha ezeket. Továbbá ez a két módszer é egy ezekhez közelálló másik ismert módszer [Hobson B. M. és Wide, L.: Acta Endocrinol., 46, 632 (1964) közös hátránya az, hogy a gonadotropin aktivitásánál mintegy 50%-a elvész, következésképpen az érzékeny ség csökken; továbbá bizonyos esetekben, így Prt menopauzális, menopauzális és posztmenopauzáli nőktől származó vizeletminták esetében a téves pozi tív eredmények valószínűsége is nő. A találmány szerinti eszkpz számos lehetséges kivi teli alakját a csatolt rajzlapokon látható 1—14. ábrá kon mutatjuk be. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
