174941. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új 17Ó-hidroxi-gesztogén-észterek előállítására
27 174941 28 A vegyületek feloldása Az egyes vegyületek 10,0 mg mennyiségeit 10,0 ml 99,5%-os etanolban feloldjuk. Ennek a standard oldatnak 100/jl-ét etanol-glicerin 1 : 1 térfogatarányú keverékével - 5,0 ml-re hígítjuk. Az oldatra 40 °C-on levegőt fújatva az etanolt elpárologtatjuk. Az oldat térfogatát ezután puffer hozzáadásával - glicerin nélkül - 5,0 ml-re beállítjuk. A vegyületek inkubálása A vegyületeket glicerin-puffer 1 :1 arányú keverékével összesen 300/ul inkubáló közegben 10 "8 — 10 "5 mól végső koncentrációra hígítjuk. 100/il-t mindegyik vegyület minden egyes hígításából kis centrifugacsövekben (2ml-es) 100/d (10 pg) 3H-progeszteronnal (l,2,6,7-3H-progeszteron, 47,8 Ci/mmól, The Radiochemical Centre, Amersham, England) és 100/ul citoszollal - amelyet pufferral kb. 0,7 g/ml végső koncentrációra állítottuk be - inkubálunk. Az inkubálást 4 °C-on 16—18 órán át végezzük. A kötött és szabad radioaktivitás szétválasztását 0 °C-on végezzük, dextránnal bevont aktívszén technikát alkalmazva. Minden egyes inkubált csőhöz 0,5 ml dextránnal bevont aktívszén-szuszpenziót (0,05% dextrán-70, Pharmacia, Uppsala, Svédország és 0,5% Norit A, Sigma, Saint Louis, Missouri, USA) adunk. A csöveket 10 percen belül 2-3-szor megkeverjük, majd 5 percig 100g-nél centrifugáljuk. A felülúszó részeket közvetlenül szcintillációs fiolákba (polietilén, Packard) dekantáljuk, amelyek 10 ml „Insta Gel”-t (Packard) tartalmaznak. A radioaktivitást Philips-féle folyadék-szcintillációs spektrométeren (Modell PW 4510/00) mértük, külső standarddal és automatikus kioltókorrekcióval. Si., .dard görbe a progeszteronhoz Az inkubációs csövekhez 100/zl citoszolt, lOOjul ’ H-progeszteront (10 pg) és 100/il különböző hígításé nem-radioaktív progeszteront adunk glicerin-puffer 1 : 1 arányú keverékében, 0—104 pg/100/d koncentrációban. A csöveket a fenti vegyületeket tartalmazó csövekkel együtt inkubáljuk. A radioaktivitást úgy számítjuk ki, hogy az inkubált csövekben számolt radioaktivitásból kivonjuk az azokban a est 'ekben számolt radioaktivitást, amelyekben a citoszolt pufferral (lOOjul) helyettesítettük. Számítás A nem-radioaktív progeszteron [P]i koncentrációját, ami megfelel a kötött radioaktív progeszteron [B]i 50%-ának, a------=0,5 szerkezetű standard görbéből [B]o számítjuk ki, ahol [B]i a nem-radioaktív progreszteron kötött radioaktivitása különböző koncentrációknál, és [B]o a kötött radioaktivitás, amikor a progeszteron-koncentráció zérus. Hasonló módon szerkesztjük meg a görbéket minden egyes X vegyületre, és kiszámítjuk minden egyes vegyületre a koncentrációt, amely megfelel 50% kötött 3H-progeszteronnak ([X]50). Kiszámítottuk és az alábbi táblázatban összegezzük minden egyes vegyület relatív kötési affinitását (relatíve binding affinity, RBA) százalékban, a progeszteronéhoz viszonyítva. Táblázat Vegyület Relatív kötési affinitás 3:3 0,6 3:2 0,7 7:4 0,9 4 :1 U 3:7 1,8 7:2 2,4 7 :1 3,6 7:3 6,3 3 :1 6,6 5 : 1 15,8 A példából kitűnik, hogy az új vegyületek specifikusan képesek koncentrálódni az emlő- és méhnyálkahártya-daganatokban gyakran található progeszteron-receptorokban dús daganatsejtekben. A 3., 4., 5., 6. és 7. példákkal analóg módon eljárva állítjuk elő az 5. táblázatban megadott szubsztituenseket tartalmazó I általános képletű szteroidokat. A vegyületek jelölése a 9. példában ismertetett módon történik, az a : b jelzéssel, ahol a a példa számát, b a vegyület sorszámát jelenti. A következő táblázatban ismertetjük a példákban előállított vegyületek jellemző NMR-spektrumának adatait. A vegyületek megnevezése a 9. példában ismertetett a : b jelzéssel történik, ahol a a példa számát, b a vegyület sorszámát jelenti. Vegyület ő-érték (ppm) 3 :2 0,68 (s, 3H, H-18, 1,18 (s, 3H, H-19), 2,08 (s, 3H, -COCH3), 3,65 (s, 8H, 2-CH2CH2Cl), 4.62 (s, 2H, -0-C0-CH20-C0-), 5,75 (széles s, 1H, H-4), 6.63 (d, 2H, aromás H), 7,09 (d, 2H, aromás H). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
