174900. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új lizolipin antibiotikum és komponensei előállítására
7 174900 8 együtt a fenti baktériumok okozta fertőzések leküzdésére, valamint fertőtlenítőszerekként használhatók. Egyes antibiotikumokkal, például penicillinekkel szinergetikus hatás figyelhető meg. Gyógyszerkészítmények előállítása céljából az antibiotikumot helyi, enterális vagy parenterális adagolásra alkalmas szervetlen vagy szerves hordozóanyaggal keverjük el. Ehhez olyan anyagok jönnek tekintetbe, amelyek az új vegyülettel nem reagálnak, mint például zselatin, tejcukor, keményítő, magnézium-sztearát, növényi olajok, benzil-alkoholok vagy más gyógyszerészeti hordozók. A gyógyszerkészítmények például mint tabletták, drazsék, porok, kúpok, vagy folyékony alakban mint oldatok, szuszpenziók, emulziók, krémek vagy kenőcsök alkalmazhatók. Adott esetben sterilezhetők és/vagy segédanyagokat, mint tartósító-, stabilizáló-, nedvesítő- vagy emulgeálószereket tartalmaznak. Más, gyógyászatiig értékes anyagokat is tartalmazhatnak. Mint ismeretes, a fertőtlenítőszerek is elegyíthetők hordozóanyagokkal. A találmányt a következő példákban újuk le. A hőmérsékletet Celsius-fokokban adjuk meg. Az ábrák jelentése a következő: 1. ábra: lizolipin I IR-spektruma KBr-ban 2. ábra: lizolipin I UV-spektruma etanolban 3. ábra: lizolipin I NMR-spektruma CDCl3-ban 4. ábra: lizolipin I1 * * * * * * * * * * * 13C-NMR-spektruma teljes zajlekapcsolással 5. ábra: lizolipin, I13C-NMR-spektruma, „off-resonance” 6. ábra: tri-O-acetil-lizolipin I NMR-spektruma ábra: nem teljesen tiszta lizolipin X NMR spektruma 8. ábra: lizolipin X UV-spektruma CHCl3-ban. A táblázatok tartalma: 1. táblázat: lizolipin I tömegspektruma 2. táblázat: lizolipin I13C-NMR-spektruma 3. táblázat: Di-O-acetil-lizolipin I tömegspektruma. 1. példa Streptomyces violaceoniger Tü 96 NRRL 8097 törzs liofllizált spóraszuszpenzióját tartalmazó ampullához 5 ml 0,2 M foszfátpuffert (pH 7) adunk. Egy-egy terelőlemezzel („baffle”) ellátott 3 db Erlenmeyer-lombikban levő 100—100 ml tápoldathoz - amely literenként 4 g élesztőkivonatot, 10 g malátakivonatot és 4 g glükózt tartalmaz folyóvízben oldva és amelynek a pH-ját sterilezés előtt 1 N nátronlúggal 7,3-ra állítottuk be - egyenként 2 ml Streptomyces-szuszpenzióval beoltunk és 24 óráig körforgó rázógépben (250 fordulat/perc) 27°-on inkubálunk. A kapott tenyészet 25—25 ml-ét beoltjuk 6 db 2 literes, 4—4 terelőlemezt és 500 ml fenti tápoldatot tartalmazó Erlenmeyer-lombikba. A lombikokat forgó rázógépben percenkénti 120 fordulattal 27°-on 48 óráig inkubáljuk. A 2 literes lombik tenyészetének 0,75 literét 30 liter fenti tápoldatot tartalmazó 50 literes eijesztőkádba visszük át és 24 óráig 27°-on inkubáljuk. Ezután a tenyészet 15 literét 300 liter fenti tápoldatot tartalmazó eijesztőkádba visszük át. Az utóbbi teljes térfogata 500 liter és 6-lapátos turbinakeverőt és 4 terelőlapot („baffle”) tartalmaz. Az eijesztőkádban a tenyésztési körülmények a következők: nyomás 0,5 atü, keverési sebesség 450 fordulat/perc, hőmérséklet 27°, levegőáthaladás 1 liter/perc. A feltételek szulfítoldatban mért 150 mM 02 /liter/óra oxigén-abszorpciós ütemnek felelnek meg. A lizolipin-antibiotikum optimális képződése mintegy 100 óra inkubálás után következik be. Ekkor a tenyészoldat pH-ja 7,5. Bacillus subtilissel végzett agar-diffúziós próbában 14-15 mm-es gátlási zóna képződik, 6 mm átmérőjű Whatman A szűrőpapír-korongokat alkalmazva. 2. példa Az 1. példa szerint kapott tenyészoldat 600 literét 2% „Dicalite” (diatómaföld) szűrési segédanyag hozzáadásával leszűrjük. 560 liter szűrt tenyészlevet nátriumhidroxid-oldattal pH 9,0-ig meglúgosítunk és folyamatos működésű extraktorban 2 :1 arányban kétszer kloroformmal extraháljuk. Az inaktív raffmátumot elöntjük. A 600 liter kloroform-fázist vákuumban bepároljuk. 290 g szárazanyag marad vissza, melyet 2 liter petroléterrel digerálunk. Az inaktív petroléter-kivonatot elöntjük és az oldhatatlan részt vákuumban megszárítjuk. Sárgásbarna, félszilárd maradékot kapunk (46 g). 3. példa A 2. példa szerint kapott nyerstermék 2,8 g-ját 73 cm hosszú, 3 cm átmérőjű SephadexR LH—20 (alkilezett térhálósított dextrán) oszlopon kloroform/ metanol (1:1) eleggyel 20 ml/óra sebességgel kromatografáljuk. 5 ml-es frakciókat fogunk fel. A frakciók relatív lizolipin I tartalmát 360nm-nél fotometrikusan határozzuk meg, a 40-47. frakcióban mért lizolipin I tartalmat önkényesen 1-nek vesszük. A következő eloszlást találjuk: Frakció Mg szárazanyag Relatív lizolipin I tartalom 1-27. 40 0,05 alatt 28-29. 30 0,46 30-39. 524 0,58 40-47. 618 1 48-55. 234 0,29 56-80. 233 0,1 alatt 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
