174900. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új lizolipin antibiotikum és komponensei előállítására
3 174900 4 közben levegővel vagy oxigénnel, rázólombikban vagy az ismert fermentorokban. Alkalmas tenyésztési hőmérséklet a 18-40 °C, különösen 27 °C. Ilyen körülmények között lényeges antibiotikus hatást a tápoldat általában 3—7 nap múlva mutat. Előnyösen több fokozatban hajtjuk végre a tenyésztést, azaz először egy vagy több előtenyészetet készítünk folyékony tápközegben, amelyet azután a tulajdonképpen tenyésztőközegbe oltunk át például 1 :20 arányban. Az előtenyészetet például úgy állítjuk elő, hogy a táptalajon körülbelül 14 napos tenyésztéssel kapott spórás micéliumot folyékony közegbe átoltjuk és 72 óráig növekedni hagyjuk. Az antibiotikumot a szűrt tenyészlében kapjuk meg. Utóbbiból az antibiotikumot önmagukban ismert módszerekkel izoláljuk, tekintetbe véve az antibiotikum kémiai, fizikai és biológiai, különösen lipofil tulajdonságait. Az antibiotikus hatás tesztelésére (azaz az antibiotikum jelenlétének a kimutatására) tesztorganizmusként különösen a Bacillus subtilis alkalmas. A szűrt tenyészléből az antibiotikum vízzel nem elegyedő lipofil oldószerrel, például etil-acetáítal, szénhidrogénekkel, mint ciklohexánnal, benzollal, vagy halogénezett szénhidrogénekkel, például metilén-kloriddal, kloroformmal, szén-tetrakloriddal, tetraklór-etilénnel vonható ki. Az oldószer lepárlása után kapott nyerstermék tisztításához például extrakciót, kicsapást, egymással nem elegyedő oldószerek közötti megoszlást, vagy adszorpciót, mindenek előtt kromatográfiát alkalmazunk. A lipofil kísérőanyagok nagy része a nyerstermék petroléteres extrakciója útján eltávolítható. A nyerstermék — például metanolban - fel is oldható és a kísérőanyagoktól adszorbensekkel, így aktívszénnel, szilikagéllel, magnézium-szilikáttal, alumínium-oxiddal vagy ezek keverékével, vagy adszorbens gyantákkal, például térhálósított dextránokkal, mint „Sephadex”-ekkel (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala) elválasztható. A nyerstermék például ismételt oszlopkromatográfiával tisztítható, célszerűen aktívszén-adalékot tartalmazó szilikagélt alkalmazva. Az antibiotikumot előnyösen kloroform vagy szén-tetraklorid és metanol elegyekkel, gradiens-eljárást használva eluáljuk, melynek során a polárisabb oldószer %-os arányát fokozatosan növeljük. A fent említett, egymással nem elegyedő oldószerfázisok közötti megoszlás ellenáramú extrakció formájában Craig-készülékben is végrehajtható. Oldószerrendszerként például kloroform, ciklohexán, metanol és víz elegye szolgálhat. Az antibiotikum egyes egységes komponenseinek kinyerése céljából az elválasztáshoz és izoláláshoz például preparatív rétegkromatográfiát használhatunk. az analitikai kimutatásra leírt körülmények között. Előnyösebb az oszlopkromatográfiával történő elválasztás, melyhez adszorbensként például 1-5% aktívszenet tartalmazó szilikagélt használunk és az elüciót előnyösen gradiens-technikával, kioroform/metanol eleggyel hajtjuk végre. A kevésbé poláris oldószer koncentrációját célszerűen kisebb fokban emeljük, így például a kloroform koncentrációját 5-től 20%-ig növeljük, vagy pedig folyamatos gradiens-elúciót alkalmazunk. A tisztítási eljárás adott esetben megismételhető. A Merck cég szilikagél-lemezeivel készült rétegkromatogramon (Kieselgel 60, F 254) a kompo- 5 nensek Rf-értékei a következők: kloroform/metanol (9:1) elegyben X = 0,58, 1 = 0,81, benzol/metanol (9 :1) elegyben X = 0,26, I = 0,30, kloroform/aceton (5 : 5) elegyben X = 0,40, 1 = 0,53, 10 benzol/aceton (5 : 5) elegyben X = 0,47, I = 0,74. Hígítási sort alkalmazó próbában lizolipin I-re a következő minimális gátló koncentrációkat (MIC) kaptuk: 15 Mikroorganizmusok MIC y/ml Lizolipin I 20 Eubacteriales (Gram-negatív) Achromobacter geminiani (27 ) >0,0025 <0,005 Salmonella minnesota (37 ) >0,5 <1 Salmonella typhimurium (37°) >100 Proteus vulgaris (37°) >0,001 <0,0025 25 Eubacteriales (Gram-pozitív) Arthrobacter aurescens (27°) >0,001 <0,0025 Arthrobacter crystallopoietes (27°) >0,001 <0,0025 30 Arthrobacter simplex (27°) >0,001 <0,0025 Bacillus brevis (37°) >0,025 <0,05 Bacillus megaterium (37°) >0,001 <0,0025 Bacillus subtilis (37°) >0,001 <0,0025 Brevibacterium flavum (27°) >0,001 <0,0025 35 Clostridium pasteurianum (30 ) >0,001 <0,0025 Chromobacterium violaceum (27°) >0,1 <0,5 Corynebacterium poinsettiae (27°) >0,001 <0,0025 40 Corynebacterium rathayi (27°) >0,001 <0,0025 Micrococcus luteus (27°) >0,001 <0,0025 Micrococcus roseus (27°) 0,001 0,0025 Sarcina lutea (27°) 0,001 0,0025 45 Staphylococcus aureus (37°) 0,001 0,0025 Pseudomonadales Pseudomonas fluorescens (27°) 0,001 0,0025 50 Pseudomonas saccharophilia (27°) 0,001 0,0025 Lizolipin X-re a minimális gátló koncentráció (MIC) 10-50-szer magasabb. 55 A lizolipin I-komponense a következő kémiai és fizikai tulajdonságokat mutatja: Sötétbarna kristályos anyag, amely vízben, vizes savakban és lúgokban gyakorlatilag oldhatatlan, kisszénatomszámú alkanolokban, mint metanolban, 60 etanolban, n-propanolban, valamint éterben és petroléterben részlegesen oldódik. Acetonban, dimetil-formamidban, dimetil-szulfoxidban, etil-acetátban, szénhidrogénekben, például ciklohexánban, benzolban és halogénezett szénhidrogénekben — mint 65 említettük — jói oldódik. 2
