174891. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimatikus átalakítások végrehajtására vizes közegből apoláros folyadékokkal elválasztható enzimkészítményekkel
9 174891 10 Az áramlási sebesség, a reaktorban való tartózkodás ideje és a reakció egyéb paraméterei az enzimkészítmény/szubsztrát rendszer tulajdonságainak függvényei. Az eló'zetes tapasztalataink azt mutatják, hogy egy 10 000 literes reaktorban 1000 kg penicülin-aciláz alapú enzim-készítményt használva, melyet Gantrez AN 149 hordozóra vittünk fel, körülbelül 2000 kg penicillin-G-t nyerhetünk naponta 5 súlyszázalékos koncentrációban 22 °C-on és pH = 7,8 értéken, bár ezt az értéket magasabb specifikus aktivitású enzim-készítménnyel tovább növelhetjük. A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg közelebbről az oltalmi kör korlátozása nélkül. A példákban a következő rövidítéseket használjuk a polimerek, a módosított polimerek, enzimek, kötő-csoportok, apoláros-csoportok és kapcsoló ágensek jelölésére: Enzimek: L lipáz PA penicillin-aciláz T tripszin Hordozók: F Ficoll GAN Gantrez SF Sepharose T2000 Dextran T-2000 Enzim/Hordozó kötő-csoport: HD 1,6-diamino-hexàn Apoláros-csoportok: D n-decü-amino-DD n-dodecü-amino-OD n-oktadedl-amino-Kötő-ágensek, aktiváló ágensek és aktiváló csopor tok: CMC l-ciklohexü-3-(2--morfolino-etil)-karbodiimid-metano-p-toluol-szulfonât G glutáraldehid A Hidrazin A következőkben a teljes jelölés kialakítását mutatjuk be: Például az 1. példa szerinti enzimkészítmény jelzése: PAFHDDG. Az enzim ily módon penicillinaciláz (PA). A hordozó: FICOLL (F), mely hexametüén-diamin-csoportot (HD) tartalmaz az enzim kapcsolására és decü-csoporttal (D), mint apoláros csoporttal rendelkezik. Az enzim és a hexametilén-diamin szabad aminocsoportja közötti kapcsolásra glutáraldehidet (G) használunk. Ugyanígy G AN 149 HDOD azt a módosított hordozót jelenti, amelyet Gantrez 149-ből 1,6-diamino-hexán és oktadecil-amin módosításával kaptunk, tehát PAGAN 149 HDOD-G azt jelenti, hogy a fenti módosított hordozót penicülin-aciláz enzimhez kapcsoltuk glutáraldehid jelenlétében. 1. példa a) n-Decil-amino, (6-amino-hexü-amino)-Ficoll (FHDD-1) 5 g Ficoll-t 300 ml vízben oldunk és az oldat pH-ját 11,0-ra állítjuk. Az elegyhez lg ciánbromidot adunk és 2 n nátrium-hidroxiddal állandó pH-értéket tartunk a reakció folyamán. A szobahőmérsékleten folyó, 20 perc időtartamú reakció befejezése után 4 g n-decil-amin és 0,5 g 1,6-diamino-hexán 10 ml metanolos oldatát adjuk az elegyhez. 2n sósavval a pH-t 9,5-re állítjuk, majd az elegyet 16 órán át 4 °C-on keverjük. Az így kapott kolloid oldatot 22 000 g értéken 1 órán át centrifugálva 35 g nedves súlyú fehér üledéket kapunk, amelyet félreteszünk. A zavaros felső fázist elöntjük. b) Penicillin-aciláz n-decil-amino, (6-amino-hexil-amino)-Ficoll (PAFHDDG—1) 21,6 g nedves súlyú FHDD-l-t 20 ml (pH = 6,0 értékű) 0,1 M nátrium-foszfát-pufferrel keverünk össze, majd a pH-t 2n sósavval 6,2-re állítjuk. E.coli penicillinaciláz oldatát (50 ml, 340 mg részben tisztított protein) 0 °C-on pH = 6,2-re állítjuk és 5 ml 25 súly%-os vizes glutáraldehid-oldatot adunk hozzá. 0 °C-on 30 percig keverjük, majd az elegyhez hozzáadjuk az FHDD—1 szuszpenzióját. Az elegyet 0 °C-on 3 órán keresztül, majd 4 °C-on további 4 órán át keverjük, majd 16 órán keresztül —20 °C-on tartjuk. Felolvadás után a szuszpenzíót 20 000 g/4 °C-on » centrifugáljuk 45 percen keresztül, és így barna gél-szerű üledéket kapunk. A gélt 30 ml 0,1 M nátrium-foszfát pufferrel (pH = 7,0) újra-szuszpendáljuk és 20 000 g/4 °C-on 30 percig újra centrifugáljuk. A felső fázisokat összegyűjtjük és a barna üledéket, melynek közelítő súlya: 6,3 g, 0,1 M (pH = 7) nátriumfoszfát-pufferral szuszpendáljuk és 4 °C-on tároljuk. A szuszpenziót legalább a saját súlyának megfelelő n-dekanollal keverjük össze, a dekanol a vizes oldat felszínén helyezkedik el, egy enzimmentes alsó fázist hagyva. Az üledék, a felső fázis és az eredeti enzim aktivitását mutatjuk be az 1. táblázaton. Mint látható, az eredeti enzimaktivitás mintegy 43%-a nyerhető vissza, gyakorlatüag kötött állapotban. A penicillin-oldatokból a komplex aktivitás flotációval vagy szokásos centrifugálással nyerhető vissza. 1. táblázat PAFHDDG—1 penicillin-acüáz aktivitása Vizsgálati módszer: Penicillin G-t (Na-sót) megfelelő koncentrációban 20 ml 0,02 M nátrium-foszfát-pufferben oldunk pH = 7,8 értékben, 37 °C-on és ehhez adjuk az enzim-mintát. A pH-t 0,1 n vagy 0,5 n nátriumhidroxid-oldat adagolásával állandó értéken tartjuk, és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
