174887. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonococcus szálak előállítására
17 174887 18 Előnyösnek találtuk például olyan közeg előállítását, amely 2-5 g száraz céziumkloridot tartalmaz 10 ml vizes közegben. Különösen előnyösnek bizonyult 20 ml vizes közegben 7,5 g céziumklorid alkalmazása. 5 Az elegyet ezután 110—250 KG közötti, előnyösen 200 KG intenzitással pörgetjük a centrifugán 30—60, előnyösen 42 órán át, és mérjük a centrifugacső egy adott pontján a frakciók optikai sűrűségét. A 280 nm-en végzett optikai sűrűségmé- 10 rések egyetlen maximumot mutatnak. A fenti maximum alatti sűrűségfrakciókat elválasztjuk és dializáljuk kis pH-értékű puffer alkalmazásával. így a fentiek során ismertetetthez hasonló módon kapjuk meg a GC szál kristályokat. Az ebben a 15 pontban 20°C-on és 10,1 pH-értéken összegyűjtött oldatfrakciók tényleges sűrűségtartománya 1,35—1,33 között van. Agglutinációs teszt a Neisseria gonorrhoeae 20 antitestek kimutatására Az agglutinációs teszt alapja a GC szál kristályoknak illetőleg a különálló GC szál pálcikáknak az alapvető képessége, hogy a Neisseria gonorrhoeae 25 antitestek jelenlétében agglutinálódnak. Ennél a vizsgálatnál a feltehetően Neisseria gonorrhoeae organizmusokkal fertőzött személyek vérszérumát GC szál kristályokkal vagy különálló GC szál pálcikákkal elegyítjük, és megfigyeljük, hogy bekö- 30 vetkezik-e a kristályok vagy a pálcikák agglutinációja. Ahhoz, hogy ezt a tesztet helyesen értékelhessük, három fontos tényezőt kell megvizsgálnunk. Először, a teszt célja nem az ismert, „tenyésztést” 35 alkalmazó teszt helyettesítése, hanem szűrővizsgálatul szolgálhat a Neisseria gonorrhoeae fertőzés meghatározására. A teszt eredménye ezért pozitív azoknál a személyeknél, akik néhány napnál hoszszabb ideje aktívan fertőzöttek, továbbá azoknál, 40 akik valamikor megkapták a betegséget, azóta azonban meggyógyultak. A harmadik megjegyzés az, hogy az igen frissen fertőzött vizsgálati alanyokban esetleg még nem termelődött annyi antitest, hogy a teszt pozitív 45 eredményt adhasson. Ha a teszt során pozitív eredményt kapunk, az illető vizsgálati alanyt a hagyományos „tenyésztést” alkalmazó vizsgálatoknak kell alávetni. Tekintettel arra, hogy a Neisseria gonorrhoeae 50 fertőző formáihoz tartozó szálak több specifikus immunológiai determinánssal rendelkeznek, meghatározott törzsek szálai egyet vagy többet tartalmaznak e determinánsok közül. Ezért ahhoz, hogy a szűrővizsgálat hatékony legyen, olyan GC szál 55 kristályok alkalmazásával kell azt elvégeznünk, amelyek átfogják az immunológiai determinánsok teljes spektrumát. A találmány szerinti agglutinációs teszthez alkalmazott GC szál kristályokat a fentebb már ismer- 60 tetett, találmány szerinti eljárással állítjuk elő. Az agglutinációs tesztet a vizsgált személytől származó szérum vagy plazma alkalmazásával végezhetjük el. Ezért a leírásban az agglutinációs teszttel kapcsolatban akár szérumot, akár pedig plazmát 65 említünk, tulajdonképpen mindkettőt értjük. A vizsgálathoz rendkívül kis mennyiségű szérum vagy plazma szükséges. Kielégítőnek találtuk azt, hogy tűvel megszúrjuk a vizsgált személy ujját, néhány csepp vért veszünk, amelyet kisméretű, 250 mikroliter körüli térfogatú centrifugacsőben centrifugálunk. Ekkor 10—20 mikroliter plazmát kapunk, amely elegendő az agglutinációs teszt elvégzéséhez. Az ilyen típusú teszteket általában különböző hígításokban hajtják végre. A szérumot ezért hígítószerrel előre meghatározott módon (rendszerint hígítássorozat készítésével) felhígítjuk. A hígítószer típusa nem kritikus, feltéve, hogy nem zavarja a tesztet. Bármilyen vizes pufferoldatot, például foszfátpuffert tartalmazó fiziológiás sóoldatot vagy írisz puffert tartalmazó fiziológiás sóoldatot használhatunk, amelynek a pH-értéke 7,0-7,5 között van. Előnyös a 7,2-es pH-értékű, írisz puffert tartalmazó fiziológiás sóoldat alkalmazása. Az agglutinációs teszt során GC szál szuszpenziót adunk a hígított szérumhoz, olyan mennyiségben, hogy a GC szál kristályok végső koncentrációja 10-50 mikrogramm/ml legyen. Azt tapasztaltuk, hogy a legjobb eredményeket kisebb GC szál kristály koncentrációnál kaptuk. Ezért a vizsgálati szérumban a standard antitest szint megállapításához, összehasonlítási célokra önkényesen 20mikrogramm GC szál kristály per milliliter hígított szérum (vagy plazma) értéket vettünk standardnak. Miután a szál kristályokat a hígított szérummal elegyítettük, az elegyet inkubáljuk. Az inkubálási idő nem kritikus, és lehet mindössze 15 perc, vagy akár 48 óra, a kapott eredmény csak elhanyagolható mértékben változik. A találmány szerinti agglutinációs teszt egy gyorsan kivitelezhető változatánál a szérum/GC szál elegyet 1—3 percig keverjük kézzel egy tárgylemezen, s hasonló eredményeket kapunk, mint a hosszabb inkubálásnál, csupán az érzékenység valamivel rosszabb. Az inkubálás hőmérséklete sem .lényeges mindaddig, amig 0—45 °C között dolgozunk. Előnyösebb azonban az elegyet 22—40 °C között, célszerűen 22 °C körül tartani legalább 15 percig. Ha az elegyet ezután akár 4 °C-on tároljuk 24 órán át, a titer akkor sem változik jelentősen. Kielégítő eredményeket kaptunk 30 percig 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálással. Az inkubálás befejezése után egy alikvot részt megvizsgálunk mikroszkóp alatt, megfigyeljük és kiértékeljük az agglutinációt. A kiértékelés az ilyenfajta teszteknél szokásos önkényes relatív értékekkel történik. Ezek: 4+, 3*, 2+, 1+, ± és -. Egy adott minta titerének meghatározásakor utolsó leolvasásnak azt az utolsó hígítást vesszük, amely 1+ agglutinációt ad. Az 1+ érték mutatja a legkisebb, még észrevehető agglutinációt egy standard összehasonlító mintához képest. Tekintettel arra, hogy a titer leolvasások GC szál kristály sarzsonként eltérőek lehetnek az állapotuktól függően, tanácsos a tesztet olyan módon ellenőrizni, az elvégzéskor, hogy ismert agglutinációs titerű antiszérumokkal is reagáltatjuk a GC szál kristályokat amellett, hogy a szokásos 9
