174887. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonococcus szálak előállítására
9 10 organizmusok okozzák az emberek gonorrea betegségét, és csupán ezek a változatok rendelkeznek szálakkal. Az alábbiakban ismertetett eljárások Ti és T2 típusú organizmusok tenyésztésére alkalmazhatók. Megjegyzendő, hogy a Neisseria gonorrhoeae törzsek betegektől vett testváladékokból izolálhatok. Ezek a váladékok rendszerint nemcsak a kívánt Ti vagy T2 típusokat, hanem a nem-szálas T3 és T4 típusokat is tartalmazzák. Megjegyzendő továbbá, hogy ha egy tenyészet például eléggé tiszta T2 típusként kezdődik, idővel az altenyészetek során nem szálas Ts és T4 típusokat, valamint Tj típust is létrehoz. A Ti és T2 telepváltozatok tenyészetében egy harmadik szálas változat is megfigyelhető, amelyet önkényesen Tr jelöléssel látunk el. Ennek a változatnak a külső megjelenése durva, és bár teljesen jellemzett, úgy véljük, hogy szoros kapcsolatban van a Ti és T2 típusokkal, mivel ezeket a típusokat kapjuk a Tr telepek altenyészetéből. A szálhozam a Tr típusokból ugyanolyan, mint a T2 tenyészetekből. Ahhoz, hogy maximális legyen akár a T2, akár pedig a Ti szálak hozama, bizonyos előzetes műveleteket kell alkalmaznunk. Az eredeti mintákat Thayer Martin lemezeken (T-M lemezeken) tenyésztjük, amelyek biztosítják a Neisseria gonorrhoeae növekedését, ugyanakkor azonban gátolják a legtöbb egyéb baktériumét. Tekintettel arra, hogy a T—M lemezek nem alkalmasak a telepváltozatok megkülönböztetésére, a telepeket a T-M lemezekről megfelelő táptalajokra visszük át (például GC közeg, Difco katalógusszám 0289-1). Egymásutáni altenyészeteket állítunk elő a telepekből a GC közegen, mindaddig, amíg a telepek a kívánt típusnak több mint 90%-át nem tartalmazzák. Jóllehet az eljárás egyformán jól alkalmazható mind a Ti, mind pedig a T2 típusra, és — mint kimutattuk — a Ti és T2 típus immunológiailag hasonló, célszerű szétválasztva tartani a típusokat. Az alábbiak során a T2 változattal fogunk foglalkozni. Kivéve, ahol az eltérésekre külön felhívjuk a figyelmet, a T2 típus tenyésztésére alkalmazott eljárások egyformán alkalmazhatók Ti-re is. Ha a tenyészet a lemezen 90% feletti mennyiségben tartalmaz mondjuk T2 telepeket, a tenyészetet eltávolítjuk a lemezről és megfelelő fagyasztó közegben, például bisz(trimetilszilil)-acetamid-glutaminban szuszpendáljuk, alikvot részekre osztjuk, és alacsony hőmérsékleten, célszerűen -70 és -196 °C között tároljuk. Amint korábban már említettük, a kezdetben nagyrészt T2 típust tartalmazó minták hajlamosak arra, hogy az altenyészetek során instabilokká váljanak, és kevesebb T2 típust szolgáltassanak. Ezért a tenyésztés során ügyelnünk kell egyrészt a T2 organizmusok nagy kezdeti arányára, másrészt pedig arra, hogy eléggé „fiatal” törzset alkalmazunk, azaz olyat, amelyből nem készült túlságosan sok altenyészet, hogy ilyen módon védekezzünk az instabilitás fellépése ellen. Ha Ti típusú szálakat kívánunk előállítani, még fontosabb, hogy 90% feletti T, tartalmú anyagot használjunk a táptalaj beoltására. A GC szál előállításához az oltóanyagot olyan módon készítjük el, hogy a primer, célszerűen, de 5 nem feltétlenül fagyasztott alikvot részekből GC közeget tartalmazó Petri-csészébe öntünk bizonyos mennyiséget, és 12—24 órán át folytatjuk az inkubálást. Az inkubációs idő 12-15 óra a kevésbé stabil T2 típusokat tartalmazó törzseknél, míg 10 12—24 óra a,stabilabb T2 típusokból álló törzseknél. Előnyösen az oltóanyagot 35-37 °C közötti hőmérsékleten tenyésztjük, jóllehet a 35 °C alkalmazását tartjuk előnyösnek. A nagy relatív nedvességtartalmú körülmények szintén előnyösek. 70% 15 alatti relatív nedvességtartalomnál a szálhozam kisebb, mint nagyobb nedvességtartalomnál. Ezért kívánatosnak tartjuk a 70-90% közötti relatív nedvességtartalom alkalmazását. Jóllehet nem tudjuk pontosan, hogy az atmoszféra milyen hatást 20 gyakorol a tenyésztésre, és a régebbi Neisseria gonorrhoeae tenyészetek széndioxid hozzáadása nélkül is növekednek, igen előnyösnek találtuk az 5—10% széndioxidot és 90-95% levegőt tartalmazó atmoszférákban történő tenyésztést. 25 Az eredeti beoltás után, amikor a lemezt 50—75%-ban borítja a tenyészet, a tenyészetet eltávolítjuk róla. Előnyösen úgy járunk el, hogy kis mennyiségű steril aminosav-oldatot adunk a beoltott lemezhez, és a tenyészetet steril üvegbot 30 segítségével lekaparjuk. Lemezenként 5-6 ml oldatot használunk, és az így kapott szuszpenzióból 2—3 ml elegendő a nagyobb méretű tálakban elhelyezett GC közeg beoltására. A tálakban az inkubálást ugyanannyi ideig és ugyanolyan körül- 35 mények között folytatjuk, mint a Petri-csészékben történő oltóanyag-előállítást, és a szálakat összegyűjtjük. Ennél a lépésnél már nem szükséges steril módszerek alkalmazása, jóllehet természetesen 40 ugyanúgy, mint mindegyik műveletnél, kívánatos tiszta felszerelés és tiszta reagensek használata, valamint az, hogy az összes műveletet a lehető legalacsonyabb hőmérsékleten végezzük a nemkívánatos baktériumnövekedések megakadályozására. 45 A gonococcus tenyészetet alkalmas puffer segítségével gyűjtjük össze. A pufferoldat vegyi összetétele nem kritikus, a pH-tartománya azonban fontos. Nyilvánvaló okok miatt a T2 szálak tisztításakor a pufferoldat nem használható 9,3 50 pH-érték feletti tartományban. Előnyösen 5,5-9,2 közötti pH-értéken dolgozunk, különösen előnyösen pedig 7,0—8,6 között. Ha túlnyomóan T, tenyészetet alkalmazunk, a pH értéke ne haladja meg a 7,7-et, hanem 5,5-7,5 között, előnyösen 55 7,0-7,2 között legyen. Ezek a pH-tartományok biztosítják, hogy valamennyi szál anyag aggregált állapotban maradjon. Legelőnyösebb puffe roldatként a trisz puffert [trisz(hidroxi-metil)-amino-metán] tartalmazó fizio- 60 lógiás konyhasó-oldatot említhetjük meg. A találmány szerinti eljárás előnyös változata szerint a mosó pufferoldatot a táptalaj felületére visszük fel, a tenyészetet lekaparjuk a táptalajról megfelelő segédeszköz segítségével, majd pedig a 65 vizes szuszpenziót alkalmas módon, például pipet-5
