174887. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonococcus szálak előállítására
25 174887 26 Ha a T2 szálak helyett T, szálak elkülönítése a cél, a fentiek szerint járunk el, de a írisz puffert tartalmazó fiziológiás sóoldat kezdeti pH-értéke 7,0-7,2 lesz. 5 8. példa A GC szálak további tisztítása A 7. példa szerint előállított szemcsét körülbelül 10 a térfogata 30-szorosának megfelelő mennyiségű, 10,1 pH-értékű etanolamin pufferoldatban szuszpendáljuk. A centrifugacsöveket enyhén forgatjuk a szemcse feloldása céljából, majd a szuszpenziót 60 percig centrifugáljuk 31 KG intenzitással. A folya- 15 dék tisztáját dekantáljuk, a szemcsét pedig elöntjük. A folyadékot a 7. példában leírtak szerint dializáljuk írisz puffert tartalmazó fiziológiás sóoldat jelenlétében, a kapott kristályos anyagot pedig centrifugálással különítjük el, szintén a 7. pél- 20 dában leírtaknak megfelelően. A szemcsét újból etanolaminban szuszpendáljuk az előzők során ismertetett módon, 0,45 mikron pórusméretű szűrőn szűrjük, ha sterilizálás szükséges, és hasonló módon ismét centrifugáljuk és dializáljuk az előzők szerint, 25 végül centrifugálással elkülönítjük. Ha a fentiek szerint előállított GC szál kristályokat bizonyos ideig tárolni akarjuk, olyan tartósítószert adunk a dialízishez alkalmazott, írisz puffert tartalmazó sóoldathoz, amely azzal összefér- 30 hető. Ilyen tartósítószer lehet például 0,05 vegyes %-os semleges vizes formaldehid-oldat, 0,01 vegyes %-os mertiolát-oldat vagy 0,02 vegyes %-os nátriumazid. Abban az esetben, ha az alkalmazott tartósító- 35 szer nem összeférhető a írisz puffert tartalmazó sóoldattal a szálak kristályosítása után, a írisz puffert dialízissel eltávolítjuk fiziológiás sóoldat jelenlétében (0,15 M vizes nátriumklorid-oldat, 18 órás dialízis). A tartósítószert egy friss sarzs fizio- 40 lógiás sóoldathoz adjuk, és 18 órán át dializáljuk a GC szál kristályok szuszpenziójának jelenlétében. A kristályokat ebben a közegben tároljuk 40 °C-on. Úgy is eljárhatunk, hogy a kristályokat tartalmazó közeget megfagyasztjuk, és -70 °C-on tároljuk. 45 Termelés Az 1. példában felsorolt Neisseria gonorrhoeae törzsekből kapott GC szál kristályok termelése - ha 50 az oltóanyag legalább 90%-ban T2 teleptípust tartalmaz, 5-15 mikrogramm/cm2 táptalajfelület. Hasonló, de valamivel rosszabb termelést kapunk a Ti típus előállításakor. 9. példa A GC szálak elkülönítése céziumklorid sűrűséggrádiens melletti 60 centrifugálással A 6. példa szerinti GC szál kristály szuszpenziót tartalmazó, 8,5-es pH-értékű, írisz pufferos sóoldat 1 ml-ét a 8,5 pH-értékű, íriszt tartalmazó fizio- 65 lógiás sóoldattal 20ml-re hígítjuk, a pH értékét 0,1 N vizes nátriumhidroxiddal 10,1-re állítjuk be, és 7,5 g száraz céziumkloridot adunk hozzá. Az oldatot 200 KG intenzitással pörgetjük 42 órán át egy Beckman L-265 centrifuga SW41 rotorjában. Frakciókat gyűjtünk a centrifugacsőből, és megmérjük minden egyes mintánál az optikai sűrűséget 280nm-nél és a törésmutatót. A törésmutató arányos a céziumklorid sűrűségével, amelyre átalakítjuk a törésmutató leolvasásokat. Az X tengelyen ábrázoljuk a frakció számát, az egyik Y tengelyen az oldat sűrűségét, a másik Y tengelyen pedig az optikai sűrűséget. A GC szálaknak megfelelő egyetlen fő maximum 1,3422 ± 0,0038 sűrűség-értéknél helyezkedik el. Az 1,35-1,33 közötti sűrűségű frakciókat egyesítjük, dializáljuk és tisztítjuk a 7. és 8. példában ismertetett műveletek alkalmazásával. Ilyen módon GC szál kristályokat kapunk. 10. példa A GC szálak gél-elektroforézise (Omstein és Davis módszere — korong-elektroforézis 1962 - Distillation Products Industries, Rochester, N.Y.) 10% akrilamid gélből (9,7% akrilamidot és 0,3% N,N’-metilén-bisz-akrilamidot polimerizáltunk N,N,N’N-tetrametil-etilén-diamin segítségével) és ammóniumperszulfátból szokásos hengereket készítettünk, és ezeket a 8,0 pH-értékű trisz-hidrokloridot és 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó gél és tartalék pufferoldatok között állítottuk fel. A felső gélfelületre 50 mikrogramm T2 szál kristály, 20 mikrogramm Cleland-reagens (0,01 M), 1 milligramm nátrium-dodecil-szulfát, 20 mikroliter glikol és 20 mikroliter 0,002%-os brómfenolkék elegyét vittük fel. Előzőleg a szálakat 2 percig melegítettük a nátrium-dodecil-szulfáttal és a Cleland-reagenssel 100 °C-on. Az elektroforézist 5 mA áramerősséggel végeztük (körülbelül 170V feszültségen), amíg a brómfenolkék frontja 6 cm-t nem haladt előre. A géleket ezután eltávolítottuk, a festéksávot keresztülvágtuk, és két gélt megfestettünk 0,2%-os Coomassie kék festékkel. Két sávot, egy nagyobb és egy kisebb sávot kaptunk. A megfestetlen géleket megfagyasztottuk, és a megfestett sávok elhelyezkedésének megfelelő sávokat kivágtuk. A nagyobb sávot a tartalék pufferoldattal extraháltuk 37 °C- hőmérsékleten 24 órán át. A pufferoldatot leszívtuk és majdnem szárazra pároltuk. A termék ismételt elektroforézise ugyanilyen Rf-értékű egyetlen sávot szolgáltatott. A kapott anyagot „GC pilin”-nek neveztük el. A GC pilin antigénképességi vizsgálata A nagyobb sávot tartalmazó gélt körülbelül 10 ml fiziológiás sóoldattal homogenizáltuk, és három kísérleti nyúlba fecskendeztük be szubkután. A Pj és Pn jelzésű kísérleti állatok 3,1 ml szuszpenziót kaptak, míg a Pm csupán 2 ml-t. 13
