174887. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonococcus szálak előállítására
21 174887 22 [Manual of Clinical Microbiology, 2. kiadás, Amer, Soc. Microbiol., Lenette és munkatársai (kiadó) 1974 920 old.]. A lemezeket körülbelül 18 órán át inkubáljuk 35 °C-on 90%-os relatív nedvességtartalmú atmoszférában, amely 95% levegőt és 5% 5 széndioxidot tartalmaz. A lemezeket megvizsgáljuk, és az erősen szálas T2 alakra emlékeztető telepeket átoltjuk a GC táptalajra. Ismét a fenti körülmények között végezzük az inkubálást, majd összegyűjtjük a T2 típus tenyészeteit, és ismét 10 ráoltjuk a GC táptalajra. A fenti eljárásnak megfelelően, ha T, típusú tenyészethez kívánunk jutni, azokkal a telepekkel oltjuk hasonló módon újra be a táptalajt, amelyekben túlsúlyban van a kevésbé szálas T, típus. Az oltóanyag tenyésztése A Thayer-Martin lemezekről eltávolított T2 típusú telepeket (I. példa) a fenti módon készített lemezekre oltjuk át, és 35 °C-on inkubáljuk 90% relatív nedvességtartalomban, 5% széndioxidot és 95% levegőt tartalmazó atmoszférában. A lemezekről fokozatosan altenyészeteket készítünk, amíg a tenyészetnek több mint 90%-a szálas T2 típusú telep nem lesz. A törzs stabilitásától függően a tenyésztési idő 12-24 óra. Ennek eltelte után a lemez 50—75%-át borítja be a tenyészet. 3. példa 2. példa A GC táptalaj előállítása 20 a) A vasat tartalmazó adalék elkészítése 0,2 súly%-os vizes kokarboxiláz-oldatot (tiamin- 25 -pirofoszfát-klorid) készítünk desztillált vízzel szobahőmérsékleten, és 0,45 mikron méretű mikropórusokat tartalmazó szűrőn keresztül történő szűréssel sterilizáljuk. 40 g glükózt, 1,0 g glutamint, 10 ml 0,5 súly%-os desztillált vizes vas(III)nitrát-ol- 30 datot és 90 ml desztillált vizet elegyítünk, és az oldatot 10 percig hevítjük autoklávban 121 °C-on és 1,09 atm nyomáson, majd az oldatot lehűtjük, és hozzáadunk 1 ml előzetesen elkészített kokarboxiláz-oldatot, amikor is megkapjuk a vasat tártál- 35 mazó adalék oldatát. 4. példa GC szálak előállítása felületi tenyésztéssel A T2 tenyészetet tartalmazó, 3. példa szerinti Petri-csészéket 5 ml 0,7 súly%-os vizes kazaminosav-oldattal mossuk. A tenyészetet steril üvegbot segítségével lekaparjuk a táptalajról, a tenyészetnek a kazaminosav-oldattal képezett szuszpenzióját pipettával eltávolítjuk a lemezről és két, 35,5 x 25,4 cm méretű tálba visszük át. A táptalajt tartalmazó tálakat a fenti módon készítjük el. A szuszpenziót egyenletesen osztjuk szét a felületen, és a tálakat 35 °C-on inkubáljuk 20 órán át, 90%-os relatív nedvességtartalmú, 5% széndioxidot és 95% levegőt tartalmazó atmoszférában. A felületi tenyészet összegyűjtése b) A táptalaj elkészítése 40 10,8 g Bacto GC közeg alapot (Difco Manual 19. kiadás, 122. oldal, Difco Laboratories, Detroit, Michigan) és 300 ml desztillált vizet elegyítünk megfelelő edényben, és az elegyet az edénnyel együtt autoklávban hevítjük 15 percig 121 °C-on és 45 1,09 atm nyomáson. Ezután az edényt kivesszük az autoklávból, lehűtjük 50—60 °C közötti hőmérsékletre, és hozzáadunk 3 ml fenti módon készített vasat tartalmazó adalékot. 50 A tenyészet leoltásához alkalmazott táptalaj-le mezek előállítása Pyrex üvegből vagy alumíniumból készült tála- 55 kát és Petri-csészéket kimosunk, desztillált vízzel öblítünk, alumíniumfóliával lefedünk és autoklávban hevítünk 30 percig 121 °C-on és 1,09 atm nyomáson. Az Üyen módon előkészített tálakba öntjük a II. példában fentebb leírt módon előállí- 60 tott és megolvasztott táptalajt. A lemezeket óvatosan kell kiöntenünk, zárt, pormentes helyiségben, aszeptikus körülmények között, hogy megakadályozzuk a nem kívánt baktériumokkal való szenynyeződést. 65 Trisz puffert tartalmazó fiziológiás konyhasó törzsoldatot készítünk olyan módon, hogy feloldunk 510 g nátriumkloridot, 363 g íriszt [kémiai neve trisz(hidroximetil)-amino-metán] és 100 ml tömény sósav-oldatot annyi desztillált vízben, hogy a törzsoldat térfogata 10 Éter legyen. Az oldat pH-értékét további tömény sósav-oldat hozzáadásával 8,5-re állítjuk be. Ha lúgosabb pH-értékre van szükség, tömény (ION) vizes nátriumhidroxid-oldatot adunk hozzá. Használat előtt a törzsoldatot felhígítjuk, úgy, hogy koncentrációja az eredeti töménység 1/6-a legyen. A trisz puffert tartalmazó fiziológiás sóoldat kezdeti pH-értéke 8,5. Ebből az oldatból 10 ml-t viszünk át a táptalajos tál felületére, a tenyészetet üvegbottal lekaparjuk, és a szuszpenziót egy edénybe pipettázzuk. A mosást és a tenyészet lekaparását megismételjük további 10 ml, trisz puffert tartalmazó fiziológiás sóoldattal, és a két mosófolyadékot egyesítjük. A táptalaj felületét harmadszor is lemossuk 10 ml 10,1 pH-értékű etanolamin pufferrel, a szuszpenziót félretesszük, de nem egyesítjük az előző mosófolyadékokkal. (Az etanolamin puffert 37,3 ml cseppfolyós etanolamin, 147,0 ml IN vizes sósavoldat és annyi desztillált víz elegyítésével készítjük, hogy az össztérfogat 1 liter legyen.) 11
