174764. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimatikus és biokémiai reakciók vizsgálatára
3 174764 4 vörös vértestek eltávolítása után kapott plazmát vagy a vörös vértestek és a fibrinogén eltávolítása után kapott szérumot kell vizsgálni. A találmány célja, hogy egyszerű módszert biztosítson biológiai reakciók vizsgálatára az említett hátrányok kiküszöbölése mellett. A találmány lényege, hogy először mérjük a kapacitást két elektród között pusztán egy szubsztrát jelenlétében, majd ismét mérjük a kapacitást annak az anyagnak a hozzáadása után, amelynek aktivitását vagy koncentrációját meg kell határozni. A kapacitás időegységre eső változása vagy teljes változása a vizsgálandó anyag aktivitására vagy koncentrációjára jellemző. Az alábbiakban a találmányt a csatolt rajzokra utalva ismertetjük részletesen. Az 1. ábra egy elektromos mérőberendezést mutat, amely alkalmas az elektródok közötti kapacitás mérésére, a 2. ábra a mérőberendezés egyszerűsített helyettesítő kapcsolása, a 3. ábra a mért kapacitásé az idő függvényében, amikor szubsztrátot adunk az oldathoz, a 4. ábra az enzimaktivitás meghatározásának sematikus rajza, az 5. ábra egy olyan görbét mutat, amely az adszorbeált szubsztrát molekulák által beborított felületre (—1 /Cs), mint az oldat szubsztrát-koncentrációjának függvényére jellemző, a 6. ábra sematikus képe annak az eljárásnak, amelynek során immunológiai reakciót vizsgálunk, és a 7. ábra sematikus rajza annak az eljárásnak, amellyel biokémiai reakciót vizsgálunk, amelyben egy szubsztrát reagál az oldatban levő enzimmel. A találmányt használhatjuk például szerinproteáz enzim aktivitásának meghatározására. Az eljárás alapja, hogy olyan szubsztrátot használunk, amely adszorbeálódik egy fémfelületen, és deszorbeálódik az enzim jelenlétében. Az 1. ábra olyan mérőberendezést mutat, amelynek segítségével a 4 oldatba merített 2 és 3 platinaelektródok közötti váltakozó áramú impadenciát mérjük. A mérőberendezés tartalmaz egy 1 impadenciahidat, egy 5 szignálgenerátort és egy 6 null-detektorral felszerelt erősítőt. A mérőberendezés kezdettől fogva csak egy pufferoldatot tartalmaz, amelynek pH-ja 8,2 és ionerőssége 0,15. Ilyen pH és ionerősség mellett optimális aktivitással rendelkeznek a vizsgálandó enzimek. Minthogy az ionerősség nagy, elektródpolarizáció következhet be, hogy a mérést viszonylag alacsony frekvencián (ebben az esetben 100 kHz-nél) végezzük. Az Rs soros ellenállást az elektrolit vezetőképessége, a C, kapacitást pedig elsősorban az elektródpolarizáció és a molekulák esetleges adszorbeált rétege határozza meg. Az 1. ábra világosan mutatja, hogy a mérőberendezést úgy kapcsoljuk, hogy az egy impedanciahíd egyik ágát képezze. Ha ekkor a pufferoldathoz egy a 3 884 896 számú USA szabadalmi leírásban említett típusú polipeptid szubsztrát kis mennyiségét adjuk, akkor a mért Cs kapacitás az idő függvényében változik, amint az a 3. ábrán látható. A C3 kapacitás az idő előrehaladásával az a görbe szerint csökken, annak függvényeként, hogy a polipeptid molekulák adszorbeálódnak az elektródok felületén. Az oldatban levő polipeptid molekulák és az elektródok felületén adszorbeálódott polipeptid molekulák között fokozato2 san egyensúly áll be. Az elektródok felületén ekkor feltehetően egy monomolekuláris réteg képződik az adszorbeálódott szubsztrát molekulákból. Ha a 3. ábrán A-val jelölt időpontban egy olyan enzim oldatát adjuk a rendszerhez, amely hasítja a polipeptidet, akkor a mért C, kapacitás újra megváltozik. A Cs kapacitás megnövekszik és visszanyeri eredeti értékét, amint azt a b görbe jelzi a 3. ábrán. A kapacitás megváltozása főként annak tulajdonítható, hogy a rendszerhez hozzáadott enzim reagál az adszorbeálódott polipeptiddel. Az enzim lehet például trombin, tripszin vagy plazmin (szerin-proteázok), amely hidrolizálja a polipeptid szubsztrátumot, miközben az adszorbeált molekulák részben vagy teljesen elszabadulnak, illetve amely felhasználódik, miközben a mérőberendezés kapacitása megváltozik. A kapacitás időegységre eső változása, vagyis a 3. ábrán feltüntetett b görbe kezdeti meredeksége az enzimaktivitás mértéke. A mérőberendezést ismert mennyiségű enzimmel lehet kalibrálni. A kalibrációs görbét azután akkor használjuk, amikor ismeretlen mennyiségű enzimet tartalmazó oldatot vizsgálunk. Ha vérplazmában végezzük a vizsgálatot, akkor az enzim mennyiségét kell meghatározni. Ezt a mennyiséget úgy határozhatjuk meg, hogy ismert mennyiségű enzimet adunk a vérplazmához. Néhány perc múlva, amikor az antienzim gátlása megtörtént, mérjük a visszamaradó enzim mennyiségét. Ha ezt az eljárást megismételjük két különböző enzim- vagy plazmamennyiséggel, akkor extrapolációval meghatározhatjuk az antienzim eredeti mennyiségét. Az enzimaktivitásnak ezt a meghatározási módját a 4. ábra mutatja sematikusan. A 4a ábra egy olyan mérőberendezést mutat, amelynek elektródjai a szubsztrát oldatába merülnek. A szubsztrát molekulái részben az oldatban vannak, részben az elektródok felületén adszorbeálódnak. Kis koncentrációnál a két rész aránya változatlan. Ha a koncentráció növekszik, akkor az elektródok felülete fokozatosan megtelik, és a rendszerhez hozzáadott molekulák egyre kisebb része adszorbeálódik. Az 5. ábrán bemutatott diagram mutatja a réteg vastagságát különféle polipeptid szubsztrát koncentrációknál. (A polipeptid 1 mM koncentrációban van jelen 0,5 ml pufferoldatban.) Amint az ábra mutatja, feltehetően egy réteg képződik az adszorbeálódott peptid molekulákból nagy peptidkoncentráció esetén. Ha további szubsztrátot adunk a rendszerhez, akkor ez inkább az oldatban levő molekulák számát növeli. Ha akkor egy enzimet adunk a rendszerhez, akkor amint a 4b ábrán látható, az E enzimmolekulák az oldatban levő molekulákkal és az adszorbeálódott molekulákkal egyaránt reagálnak. A 4c ábrán illusztrálják, hogy a soros Cs kapacitás miként változik az idő függvényében, amikor S szubsztrát molekulákat, majd E enzimmolekulákat juttatunk a rendszerbe. Minthogy a mérőberendezés csupán az adszorbeált molekulák számában bekövetkező változásokat jelzi, kívánatos, hogy elsősorban ezek vegyenek részt a reakcióban. Az érzékenységnek tehát egy bizonyos mennyiségű peptid jelenlétében optimuma van. Az érzékenység kis peptidkoncentrációnál csekély, mert az elektródok feületén bekövetkező feltöltődés igen csekély változással jár, nagy koncentrációnál viszont a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
