174695. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gentamicin, sziszomicin és garamin előállítására
17 174695 18 csapvíz 3000 liter, pH = 6,7-7,0. Az üzemi oltóanyag előállításához 180ms/ó levegőztetést alkalmazunk a keverő fordulatszáma 180/perc, hőmérsékletet 35 °C-on tartjuk. Ily módon 42-48 óra alatt az oltóanyag kifejlődik. Ekkor a kifejlődött 5 oltóanyagot átoltjuk egy 30m3-es hasznos térfogatú fermentorba, mely a következő összetételű steril fermentációs táptalajt tartalmazza: szójaliszt 900 kg, kukoricaliszt 750 kg, kálciumkarbonát 120 kg, kobaltklorid • 2H20 60 g, pálmaolaj 30 kg, 10 csapvíz 30000 liter, pH = 6,7—6,9. A fermentációt 32 °C-on folytatjuk le, a levegőztetés mértéke az első 24 órában 900 m3 /óra, ezután a fermentáció befejezéséig 1400 m3/óra, a keverő fordulatszáma 110/perc. 15 5 napos fermentáció után az összes gentamicin antibiotikum és sziszomicin tartalom 950 E/ml, (ebből sziszomicin 170 E/ml) garamin tartalom 70 gamma/ml. A fermentáció befejezésekor a 30 m3 fermentlé -0 pH-ját 2,0-ra állítjuk, keverés közben, 20%-os kénsawal. Ezután a savazott fermentlevet vákuumdobszűrőn, perlit szűrősegédanyagot alkalmazva megszűrjük. A savas szűrlet pH-ját 20%-os nátriumhidroxid oldattal pH = 6,5-7,0-re állítjuk, majd 25 3,5 kg/m3-nyi oxálsavat adunk hozzá keverés közben. Egy órai kevertetés után a pH-t 7,5-re állítjuk 20%-os nátriumhidroxid oldattal, és a kivált csapadékot — ismét vákuumdobszűrőn perlit szűrősegédanyagot alkalmazva - kiszűrjük. A szűrletből ez- 50 után a gentamicin antibiotikumokat és a garamint megkötjük Na-formában levő Wofatit CP-300-as gyantán: 3 sorbakapcsolt ioncserélő oszlopot használunk a szűrt fermentlé megkötéséhez, az oszlopok 50-50 liter gyantát tartalmaznak (oszlopok 55 mérete 300 x 1000 ml). Megkötési sebesség l,5m3/ó. 24 óra alatt a megkötést befejezzük, s vízzel való mosatás után az oszlopokat ellenáramban eluáljuk 4 n vegytiszta kénsavval. A kénsav térfogata 150 liter, az eluálási sebesség 40 15 liter/ó. összesen 250 liter főeluátumot nyerünk. Az eluátum pH-ját keverés közben trietilaminnal 4,5-re állítjuk, majd aktív szénnel derítjük (2,5 kg Norit C Extra aktív szenet használunk) s egy órai kevertetés után szűrjük. A szűrletet állandó kevertetés 45 közben 1750 liter metanolba öntjük, fél órás további kevertetés után a csapadékot kiszűrjük, majd etanollal és acetonnal mossuk. Végül vákuumban, 40 °C-on szárítjuk a csapadékot és porítjuk. így 18,85 kg gentamicin C bázissal, valamint 3,82 kg 50 sziszomicin bázissal ekvivalens, összesen 46,5 kg nyers gentamicin szulfátot nyerünk. A 46,5 kg nyers gentamicin C-sziszomicin szulfátot (mely tartalmaz többek közt gentamicin B-Bx, gentamicin A-t, gentamicin X-t, garamint is) 55 150 liter ionmentes vízben feloldjuk. Az oldat pH-ját 20%-os vegytiszta nátriumhidroxid oldattal pH = 7,0-re állítjuk, majd 2 kg aktív szénnel (Norit C Extra) derítjük, 1 órai kevertetés után vákuumszűrőn szűrjük, a szűrletet 4 db sorba- 60 kapcsolt, egyenként 125 liter NH4* formában levő Amberlite CG-50 gyantát tartalmazó kromatografáló oszlopon megkötjük, 301iter/óra sebességgel. Az oszlopot a megkötés után ionmentes vízzel, 12 órán át ugyancsak 30 liter/óra sebességgel mossuk. 65 Ezután 0,1 n ammóniumhidroxid oldattal megkezdjük a kromatogram kifejlesztését, illetve az egyes komponensek eluálását. Az ammóniumhidroxid oldat adagolási sebessége 60 liter/óra, és összesen 4600 liter 0,1 n ammóniumhidroxid oldattal fejlesztjük ki a kromatogrammot, illetve a kísérő szennyezéseket eluáljuk, a nem hasznosított gentamicin antibiotikumokat, továbbá a gentamicin B-t, a gentamicin B-l-t, a sziszomicint és a garamint. Az eluálást papír- és rétegkromatográfiás ellenőrzés mellett végezzük, és ennek alapján választjuk ki azokat a frakciókat, melyek a gentamicin B-B,-t, garamint, sziszomicint tartalmazzák. (Egy-egy frakció térfogata 60-60 liter.) Az analitikai vizsgálatok alapján egyesítjük a 74—84. frakciókat (ezek tartalmazzák a sziszomicint). Majd a 88. frakciónál az ammóniumhidroxid koncentrációját 0,3 n-ra emeljük. A 96-112. frakciók tartalmazzák a gentamicin C-t. (A fel nem tüntetett frakciókat a továbbiakban nem dolgozzuk fel.) Az egyesített 74-84-ig a frakciókat bepároljuk a térfogatuk 1/32-ére, míg az egyesített 96—112. frakciókat térfogatuk 1/14-ére. A koncentrátumok pH-ját külön-külön vegytiszta 5 n kénsavval pH = 6,0-ra állítjuk, majd aktív szénnel derítjük, 30 perc kevertetés után vákuumszűrőn szűrjük. Ezután a pH-t kevertetés közben ismét vegytiszta 5 n kénsavval 4,5-re állítjuk, majd aktív szénnel derítjük. Keverés és szűrés után a szűrlet pH-ját ismét ellenőrizzük, majd pirogénmentesre szűrjük. A koncentrátumokat tízszeres térfogatú szűrt metanolba csurgatjuk lassan, állandó kevertetés közben. A kivált csapadékokat 30 perc kevertetés után vákuumszűrőkön szűrjük. A termékeket metanollal, majd acetonnal mossuk, ezután a szűrőnedves anyagokat vákuumszárítószekrényben 40 °C-on szárítjuk, végül szitáljuk. Ily módon a következő végtermékeket kapjuk: a) A 74-84. egyesített frakciókból 4,12 kg sziszomicin szulfátot (ez megfelel 2,35 kg sziszomicin bázisnak, a termék sziszomicin szulfátra nézve 93%-os) b) A 96-112. egyesített frakciókból 25-34 kg gentamicin C szulfátot (ez megfelel 14,72 kg gentamicin bázisnak, melynek 38,5%-a gentamicin C2, 32,7% gentamicin Ci, és 28,8% gentamicin Cia, a termék e 3 komponens szulfát sójára nézve 98,5%-os tisztaságú). A végtermékeket a megadott módszer szerint papír- és rétegkromatográfiás vizsgálattal azonosítottuk. A kapott Rf (rétegkromatográfiás) értékek: sziszomicin : 0,22, gentamicin C2 : 0,28, gentamicin Ci 0,35, gentamicin C1a;0.21- A kapott papírkromatográfiás Rf értékek: sziszomicin : 0,21, gentamicin C2 : 0,38, gentamicin Cj :0,59, gentamicin Cla :0,18. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás gentamicin, sziszomicin és garamin előállítására Micromonospora törzsekkel, előnyösen a Micromonospora purpurea varietas nigrescens (X-148) MNG-00122 vagy a Micromonospora echinospora NRRL-2985, vagy a Micromonospora grisea NRRL-3800 törzzsel, azzal jellemezve, hogy 9
