174606. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tripeptidek előállítására
13 174606 14 A dimetilformamidot vákuumban lepároljuk. A maradékot 40 ml 0,4 mólos karbonát-hidrogénkarbonát pufferoldatban (pH =10) oldjuk, és az oldatot 30 ml n-butanol és 40 ml kloroform elegyével négyszer extraháljuk A vizes fázist bepároljuk, és a maradékot egymás után 50 ml, 25 ml, és ismét 25 ml metanollal extraháljuk. A metanolos oldatokat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. Maradékként L-piroglutamil-L-hisztidil-L-tiazolidin-4-karbonsavat kapunk. 615 mg (15 mmól) L-piroglutamil-L-hisztidil-L- tiazolidin-4-karbonsav 30 ml dimetilformamiddal készített oldatához 260 mg (1,7 mmól) HBT-t adunk, és az oldat pH-ját trietilaminnal 4-re állítjuk. Az elegyhez 180 mg (3,4 mmól) ammóniumkloridot, majd 385 mg (1,7 mmól+10% fölösleg) DCCI-t adunk. A reakcióelegyet éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük. Az elegyet szűrjük, és a szűrletet bepároljuk. A maradékot 20 ml 80 : 20 : 2 térfogatarányú kloroform - metanol - víz elegyben oldjuk, az oldatot 200 g szilikagéllel töltött oszlopra visszük fel. és az oszlopot a fenti oldószer-eleggyel eluáljuk. Az L-piroglutamil-L -hisztidil- L-tiazolidin-4-karbonsa vamidot tartalmazó frakciókat egyesítjük és bepároljuk. 370 mg, vékonyrétegkromatográfiás elemzés alapján szilikagél lapon oldószer-rendszerként kloroform : metanol-ammóniumhidroxid 80 : 20 : 2 elegyét alkalmazva lényegében tiszta terméket kapunk. A 3. példában ismertetett eljárással állítjuk elő az alábbi tripeptideket: L—Kic-L—His-L-Pro—NH2 Rj = 0,46(B). DL—Kpc—His-L-Pip—NH2, Pyr-Lüs-L-Pip-NH2, L-Kpc—His—L—Pip—NH2 és L—Kic—L-His-L-Tca—NH2 Rf = 0,38(A). 4. példa L—Piroglutamil—N3 im —[karboximetil ]—L—hisztidil— -L—prolin-amid előállítása 1,1 mólekvivalens monojód-ecetsavat tartalmazó dimetilformamidhoz L—Pyr—L—His—L-Pro-NH2 -t adunk. A reakcióelegyet körülbelül 18 órán át keverjük, majd az oldatot szárazra pároljuk. A szárított maradékot száraz szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk, eluálószerként 50:40:10 térfogatarányú kloroform - metanol — víz elegyet használunk. Az effluenst 5 ml-es frakciókba gyűjtjük. Az első frakciók főtermékként lényegében tiszta L—Pyr—N3im-[CH2COOH]-L-His-L-Pro-NH2-t tartalmaznak. E vegyület mellett a reakcióban L—Pyr—N'lm,N3im —di —[CHjCOOH]—L—His—L—Pro—NH2 és L—Pyr—Nlim —[CH2 COOHj—L—His—L—Pro—NH2 is képződik. Egyes esetekben az N3,m-szubsztituált-L—His-származékot jodid-sója formájában különítjük el. A sót például hidroxid-formájú Dowex 1 ioncserélő gyanta felhasználásával semlegesíthetjük, és így a szabad tripeptid-bázist kapjuk. Hasonlóan állíthatjuk elő az alábbi vegyületeket: Pyr—N3im—[n-hexil]—DL His—L—Pro—OCH3, Rf = 0.42(A) DL-Pca-N3 im -[(CH2 )4 -COOH]-L-His-L-Pro-NH2 L—Pyr—N3im—[izopropil]—DL—His—L—Pro—OC5Hi j, Kic-N3 im —[(CH2 )2 —COOH]—His—L—Tea—NH2, DL-Kpc-N3 im -[C2 Hs ]—His—L—Pip—OC2 Hs, L—Kic—N3im—[CH2 —COOHj-L—His—L—Pro—OCH3 és Pyr—N3im—[ciklohexil]—DL—His—L—Tea—NH2. 5. példa L-Piroglutamil-L-hisztidil-L-piperidin-2- -karbonsav-metilészter előállítása 1,5 g L—Pyr—L—His-NH-NH2 40 ml dimetilformamiddal készített diszperzióját keverés közben —30 °C-ra hűtjük, és a diszperzióhoz 4,08 ml 5,25 mólos tetrahidrofurános sósavoldatot adunk. Ezután az elegyhez 40 perc alatt 0,77 ml izoamilniíritet adunk (először 0,65 ml, majd 0,051 ml, 0,035 ml, és ismét 0,035 ml reagenst adagolunk be). A kapott elegyhez 965 mg (5,37 mmól) L-piperidin-2-karbonsav-metilészter-hidrokloridot, majd körülbelül 4,1 ml trietilamint adunk. A reakcióelegyet 96 órán át +5 °C-on, majd éjszakán át szobahőmérsékleten tartjuk. Ez idő alatt az elegyhez további 0,2 ml, 0,4 ml, illetve 0,2 ml trietilamint adunk annak érdekében, hogy az elegy pH-ját körülbelül 7,2 értéken tartsuk. A reakcióidő leteltével a trimetilamin-hidrokloridot kiszűrjük, és 50 ml dimetüformamid és 75 ml dietiléter elegyével mossuk. A mosófolyadékot egyesítjük a szűrlettel. Ezt a műveletet még kétszer megismételjük. Végül a kapott szűrletet és mosófolyadékokat vákuumban bepároljuk. 2,87 g nyers terméket kapunk, amelyet tisztítás céljából szilikagél-oszlopon kromatografálunk. Eluálószerként 90 :10 :1 arányú kloroform — metanol — víz elegyet használunk. A kromatografálás során 787 mg L-Pyr-L- His-L-Pip-OCHj-t [Rf = ű,49(A)] és 671 mg L—Pyr-DL-His—L—Pip—ÓCH3-t [Rf = 0.35(D)] különítünk el. Ha fenti eljárásban L-Pip~OCH3 helyett L-Pip—NH2-ból indulunk ki, L—Pyr—L— His—L-Pip-NH2-t kapunk. Rf = 0,21(A). Az 5. példáb'n ismertetett eljárással állíthatjuk elő az alábbi vegyületeket: L-Pyr-His-L-Tca-OCH3, L—Kpc—L—His—L—Pip—OCH3, Rf = 0,41(D) L-Pyr-His-L-Tca-NH2, Rf = 0.40(A) L—Kic—His—L—Pip—OC4 H,, L-Koc-His-L-Pro-NH2, L-Prl —His—L—Pro—NH2, L-Kic-L-His-L-Pip-OC, 0H2,, Rf = 0.46(D) és L-Kpc-His—L-Tca-OCH(CH3)2 Az (I) általános képletű tripeptideket a fent ismertetett módszereken kívül a TRH előállítására alkalmas, a korábban idézett irodalmi fonásokban közölt eljárásokkal is előállíthatjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
