174541. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens koleszterin meghatározásához
11 174541 12 ter inészt eráz-készít múnyt a 4. példában ismertetettekkel azonos módon alkalmazzuk koleszterin meghatározására. Egy mintát vizsgálva 179 mg% össz-koleszterint kaptunk. A szterindehidráz helyett Nocardia erythropolis- 5 ból származó koleszterinoxidázzal végzett összehasonlító vizsgálat eredménye 181 mg% össz-koleszterin. 9. példa 10 g diammóniumhidrogénfoszfátot 100 ml vízben oldunk és az oldat pH-ját 85%-os foszforsavval 7-re állítjuk be. Ezután 10s E katalázt adunk 15 hozzá. Az így kapott oldattal 100 ml-re töltjük fel 0,2 ml acetil-aceton, 10 ml metanol és 0,1 g hidroxi-polietoxi-dodekán keverékét. Ehhez az oldathoz 2,5 E Streptomyces autotrophicus, WS 90011-bó'l származó koleszterinészterázt adunk. 20 Az így kapott oldat 5 ml mennyiségét összekeverjük 0,02 ml szérummal, illetve 200 mg%-os koleszterin-standard-oldat 0,02 ml mennyiségével. A szérum-tartalmú, valamint a koleszterin-standard-tartalmú minta alikvot részeit 0,1—0,1 E koleszterin- 25 oxidázzal elegyítjük és 60 percig 37 °C-on inkubáljuk. Ezután a képződött szín intenzitását 450 nm-en fotometriásan mérjük, a vakpróba figyelembevételével. A szérum-tartalmú minta koleszterin-tartalma 30 — egy standard-nak alapértékként való alkalmazásával - 160 mg% össz-koleszterinnek adódott. Az ellenőrző vizsgálatnál - amelyet Candida rugósa ATCC 14830-ból származó koleszterinészterázzal végeztünk a Streptomyces autotrophicus 35 WS 90011-ből származó koleszterinészteráz helyett - azonos értéket kaptunk. zásával, azzal jellemezve, hogy a kötött koleszterint mikroorganizmusokból származó koleszterinészterázzal szabadítjuk fel. (Elsőbbsége: 1974. március 27.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy Candida rugósa ATCC 14830-ból, Rhizopus spec. WS 90027-ből vagy Aspergillus spec. WS 90030-ból származó koleszterinészterázt használunk. (Elsőbbsége: 1974. március 27.) 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy olyan koleszterinészterázt használunk, amely az alábbi mikroorganizmusokból származik: Actinomyces aureoverticillatus Actinomyces cyaneofuscatus Actinomyces griseomycini Actinomyces longisporus-fl. Actinomyces malachiticus Actinomyces roseolus Actinomyces toxytricini Actinomyces variábilis Streptomyces spec. Streptomyces autotrophicus Streptomyces canescens WS 90002 WS 90003 WS 90004 WS 90005 WS 90006 WS 90007 WS 90008 WS 90009 WS 90010 WS 90011 WS 90012 10. példa 40 0,5 ml szérumhoz, illetve koleszterin-standardhoz 1,0 ml 0,5 mólos, 0,4% hidroxi-polietoxi-dodekánt tartalmazó káliumfoszfát-puffert (pH = 7,5), és 2,5 E Cunninghamella elegáns WS 90025-ből szár- 45 mazó (2. példa szerint elkülönített) koleszterinészterázt adunk. A reakciókeveréket 40 percig 37 °C-on inkubáljuk. Ennek az oldatnak 0,25 ml mennyiségét 3 ml koleszterin-reagenshez adjuk, amely 2 rész ecetsavat, 3 rész ecetsavanhidridet és 50 1 rész kénsavat tartalmaz (Liebermann-Burchard-reagens). Egy standard alapértékként való alkalmazásával egy tipikus mintánál 170 mg% össz-koleszterint találtunk. Az összehasonlító vizsgálat, amelyet a koleszterinészter alkoholos kálilúggal 55 való elszappanosításával végeztünk, 166 mg%-ot eredményezett. Streptomyces chartreusis WS 90013 Streptomyces nűchiganensis WS 90014 Streptomyces murinus WS 90015 Streptomyces hachijoensis WS 90016 Streptomyces caelestis WS 90017 Streptomyces tendae WS 90018 Nocardia rubra WS 90019 Candida mycoderma WS 90020 Candida albicans WS 90021 Candida albicans WS 90022 Candida albicans Szabadalmi igénypontok: 60 Candida spec. 1. Eljárás az összes koleszterin vagy a kötött koleszterin meghatározására a kötött koleszterin Cunninghamella elegáns felszabadításával és a szabad koleszterinnek ezt követően ismert módszerekkel való meghatáro- 65 Mucor mucedo WS 90023 WS .90024 WS 9Q025 WS 90026 6
