174541. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens koleszterin meghatározásához
MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG SZABADALMI LEÍRÁS 174541 Nemzetközi osztályozás: Bejelentés napja: 1974. III. 27. (BO-1493) Német Szövetségi Köztáisaság-beli elsőbbsége: 1973. III. 28. (P 23 15 501.3) 1973. IV. 03. (P 23 16 637.2) G 01 N 31/14, G 01 N 33/16 ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL Közzététel napja: 1979. VIII. 28. Megjelent: 1980. VII. 31. Feltalálók: Szabadalmas: Dr. Beaucamp Klaus vegyész, Möllering Hans vegyésztechnikus, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim Lang Gunter laboráns, Dr. Gruber Wolfgang vegyész, Német Szövetségi Köztársaság Dr. Roeschlau Peter vegyész, Tutzing/Obb., Német Szövetségi Köztársaság Eljárás és reagens koleszterin meghatározásához 1 A találmány tárgya eljárás koleszterin meghatározásához, amellyel az összes koleszterin-tartalmat és a kötött állapotban levő koleszterint is meg lehet határozni, valamint az eljáráshoz szükséges reagens. 5 A koleszterin biológiai anyagokban, így szérumban és hasonlókban fordul elő, részben szabad alakban, részben pedig kötve, észterek alakjában. A kötött, vagy az összes koleszterin-tartalom meghatározásához először az szükséges, hogy a kötött 10 koleszterint szabaddá tegyük. Ezt eddig lúgos közegben, például alkoholos kálilúggal történő elszappanosítással végezték. Elszappanosítás után a szabad koleszterin az ismert módszerek egyikével, vegyi úton, vagy enzimatikusan határozható meg. 15 A vegyi úton történő meghatározás például a Liebermann-Burchard szerinti eljárással végezhető [Watson, D., Clin. Chim. Acta, 5 (1960) 637-643], az enzimatikus meghatározás koleszterinoxidázzal, koleszterindehidrogenázzal vagy koleszterinde- 20 hidrázzal történhet. Mivel az egyes koleszterin-észtereknek és a szabad koleszterinnek a vegyi úton történő meghatározásoknál különböző extinkciós koefficiense van, szükséges, hogy a koleszterin-észtereket lúgos hidrolízissel szabad koleszterinné 25 alakítsuk át. A kötött koleszterin lúgos elszappanosítása azonban minden esetben nehézkes és iddtrabló műveleti lépés. Ezenkívül a viszonylag agresszív reagensek alkalmazása következtében a koleszterin 30 2 is bomlást szenvedhet. A lebomlás és az ezzel együttjáró téves analitikai eredmény kiküszöbölése érdekében a hidrolízist viszonylag enyhe reakció körülmények között kell végezni, amely a meghatározás szükséges időtartamát nem kívánt módon növeli. Még hátrányosabb a koleszterin lúggal történő felszabadítása akkor, ha ezt követően a koleszterin meghatározása az előnyös enzimatikus módszerrel történik. Ismeretes, hogy az erősen lúgos közegben az enzimnek inaktiválódnak, ezért a hidrolizátumot sav hozzáadásával 5—8 pH-ra kell beállítani az enzimatikus meghatározás megkezdése előtt. Mindez azt eredményezi, hogy az összes koleszterin vagy a kötött koleszterin meghatározása még mindig hosszú ideig tart, és túlságosan sok munkát igényel. Találmányunk célkitűzése olyan eljárás kidolgozása az összes koleszterin vagy a kötött koleszterin meghatározására, amely az említett hátrányokat kiküszöböli. Az összes koleszterin vagy a kötött koleszterin meghatározására szolgáló találmány szerinti eljárás során a kötött koleszterint felszabadítjuk és azután a szabaddá tett koleszterint ismert módon meghatározzuk, az eljárást az jellemzi, hogy a kötött koleszterint mikroorganizmusokból származó koleszterinészterázzal szabadítjuk fel. Azt találtuk, hogy a koleszterinészterázzal a kötött koleszterin gyorsan és kvantitatív módon 174541
