174372. lajstromszámú szabadalom • Pillangósvirágú növények vetőmagvainak oltására szolgáló többkomponensű oltóanyag és eljására az egyik komponens előállítására
3 174372 4 ellátás, addigra már kifejtik hatásukat a gümőkben elszaporodó specifikus mikroorganizmusok. Megfigyeltük ugyanis, hogy a növény növekedésének kezdetén, amikor - bár a növekedési erély a legnagyobb - még nem érvényesül a Rhizobiumok hatása, előnyösen kihasználható a gibberellin hatása, amely éppen ebben az időszakban a csírázást és a kezdeti növekedést serkenti. Ezen túlmenően csökken a magkártevők pusztító hatása is. A találmány szerinti készítmény 20-30% Rhizobium tenyészetet, amelynek Rhizobium baktérium tartalma 2 • 10*-9 • 109/ml, 0,02-0,05% gibberellinsavat és 0,5—2% mennyiségben nyomelemeket, így kobalt-, mangán-, molibdén-, réz-, cink- és/vagy bór-vegyületeket, valamint egy vagy több vivőanyagot tartalmaz. Vivőanyagként előnyösen tőzeget alkalmazunk. A találmány szerinti készítményt magvak oltására használjuk oly módon, hogy a készítményt a vetőmagra rászórjuk és alaposan összekeverjük vele. Minden pillangósvirágú növény esetében az annak megfelelő Rhizobium baktériumot tartalmazó készítményt alkalmazunk, ezek a baktériumok ugyanis faj specifikusak. A találmány további eljárást nyújt a fenti oltóanyag hatóanyagaként alkalmazható Rhizobium tenyészet előállítására. Minthogy a klasszikus eljárással, álló tenyészetekben történő baktérium szaporítási mód mem gazdaságos, főként pedig nem alkalmas a fejlett vagy fejlődő növénytermesztés mennyiségi igényeinek maradéktalan kielégítésére, előtérbe került az alámerített, levegőztetett (fermentációs) tenyésztési eljárás bevezetése a Rhizobium baktériumok ipari méretű elszaporítására is. [M. G. Jates, Hallsworth E. G.: Some effects of coper in the metabolism of modulated subterraneum clover. Plant and Soil, (1963) 19.] A találmány értelmében úgy járunk el, hogy valamely, a pillangós növények gümőiből különös gonddal szelektált rhizobium baktériumot speciális összetételű, azaz 1,0-2,5% szénforrást, 0,2—0,6% nitrogénforrást, 0,02-0,1% mennyiségben ásványi sókat, 0,3—0,6% húskivonatot és 0,1—0,5% zabhidrolizátumot tartalmazó táptalajban, alámerített, levegőztetett tenyészetben 35-56, előnyösen 48 órán át 26—29 °C-on, előnyösen 27 °C-on tenyésztünk. A kapott tenyészetet steril körülmények között 3—10 °C hőmérsékleten tároljuk. A fermentációt előnyösen az alábbi összetételű táptalajon valósítjuk meg: 0,02% káliumdihidrogénfoszfát, 0,02% mangánszulfát, 0,3% lucernakivonat, 1,0% kristálycukor, 1,0% dextróz, 0,1% sörélesztő, 0,5% húskivonat, 0,01% káliumnitrát és 0,1% zabhidrolizátum. A táptalaj komponensként alkalmazott húskivonat előnye, hogy a baktériumok optimális növekedéséhez nélkülözhetetlen, ún. limitáló aminosavakkal és közelebbről meg nem határozott, növekedést serkentő egyéb anyagokkal is gazdagítják a táptalajt. A zabhidrolizátum alkalmazása azért előnyös, mert hatására a Rhizobium baktériumok toktermelése fokozódik, ez pedig azért fontos, mert a tokok ellenállóvá teszik a Rhizobium baktériumokat a tőzegben vagy egyéb vivőanyagban esetlegesen előforduló baktericid anyagokkal szemben. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példát adjuk meg. Példa Pillangós növények gümőiből gondosan szelektált Rhizobium baktérium agar-lemezen készített tenyészetéről a baktériumokat 5—5 ml fiziológiás konyhasó-oldattal lemossuk. A kapott szuszpenzió 2-2 ml-ével 100-100 ml alábbi összetételű táptalajt oltunk be: káliumhidrogénfoszfát 0,2 g magnéziumszulfát 0,2 g lucernakivonat (szárazanyag) 3,0 g kristálycukor 10,0 g dextróz 10,0 g sörélesztő (száraz) 1,0 g húskivonat 5,0 g káliumnitrát 0,1 g hab zásgátló 2,0 g csapvíz: ad 1000,0 ml pH: 6,8 A beoltott táptalajokat 48 órán át 27 °C-on inkubáljuk percenként 300 fordulatszámú síkkör rázógépen. Tisztasági vizsgálat után a tenyészet 100 ml-ével 10 literes üvegfermentorban levő 7 liter ugyanolyan összetételű táptalajt oltunk be, majd 27 °C-on inkubáljuk keverés (fordulatszám 300/perc) közben, és a táptalajon 1 liter táptalajra számítva percenként 0,5 liter steril levegőt áramoltatunk át. A tenyésztést 48 órán. át végezzük, majd a tiszta tenyészetet steril körülmények között lefejtjük és inokulumként az üzemi fermentorok (200—1000 literes) oltására használjuk fel. A nagyvolumenű termeléshez is az előbbivel azonos összetételű táptalajt és fermentációs paramétereket alkalmazunk. Ezt a tenyészetet ballonokba fejtjük és felhasználásig 3-10 °C hőmérsékleten tároljuk. így olyan tenyészetet kapunk, amelynek Rhizobium baktérium-tartalma 8 • 109/ml, ez az érték 3 hónap múlva 7,6 • 109/ml és 6 hónap múlva 7 • 109/ml. Ha a fenti módon járunk el, azonban a táptalajhoz a fenti komponenseken kívül még 1,0 g zabhidrolizátumot is adunk, a kapott tenyészet Rhizobium baktérium-tartalma 9 • 109/ml, 6 hónapi 3—10°C-on való tárolás után 8 • 109/ml. Ha ugyanilyen módon járunk el, azonban a fermentációt olyan táptalajon végezzük, amely nem tartalmaz húskivonatot és zabhidrolizátumot, a kapott tenyészet baktérium-tartalma 3 • 109/ml, 3 hónapi tárolás után 2 • 10w/ml, míg húskivonat 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
