174366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás uteroevakuáns hatóanyagok elkülönítésére növényi extraktumokból
5 174366 6 bonát-oldattal mossuk. Az éteres fázist vízmentes nátriumszulfát fölött szárítjuk, szűrjük, majd az oldószert lepároljuk. A kapott 44,6 g halványsárga, olajos maradékot 400 ml kloroformban oldjuk, és az oldatot kloroformmal átitatott 2,5 kg semleges kovasavval töltött, 10x120 cm méretű oszlopra öntjük. Az oszlopot kezdetben kloroformmal, majd növekvő mennyiségű izopropanolt tartalmazó kloroform-izopropanol elegyekkel eluáljuk. Az eluátumot frakciókba gyűjtjük, összesen 110 frakciót fogunk fel. Az eluáláshoz a következő oldószer-elegyeket használjuk fel: Frakció száma Egy frakció térfogata, ml Oldószer 1-7. 650 kloroform 8-30. 500 1 :41,7 arányú izopropanol-kloroform elegy 31-60. 500 1 :33,3 arányú izopropanol-kloroform elegy 61-105. 500 1 :28,6 arányú izopropanol-kloroform elegy 106-110. 500 1 :25 arányú izopropanol-kloroform elegy A frakciók összetételét vékonyrétegkromatográfiás elemzéssel (adszorbens: szilikagél, eluálószer: I :12,5 arányú izopropanol-kloroform elegy), valamint gázkromatográfiás elemzéssel (3% OVI 7 II :1 arányú metilszilikon-fenilszilikon elegy/ oszlop, 150—250 °C) vizsgáljuk. A 78-84. frakciót egyesítjük, és az oldószert vákuumban lepároljuk. 5,1 g súlyú olajos maradékot kapunk, amely gázkromatográfiás elemzés alapján legalább három fő komponenst tartalmaz. Ezüstnitráttal impregnált kovasav előállítása: 25 g ezüstnitrát körülbelül 700 ml forró metanollal készített oldatához kis részletekben, szuszpenzió képződéséig összesen 250 g kovasavat adagolunk. Az oldószert forgó bepárlón, vákuumban, 50—60 °C-on lepároljuk. A maradékként kapott szabadon folyó, porszerű szilárd anyagot tálcára öntjük, és szárítószekrényben fénytől védve 17 órán át 120 °C-on szárítjuk. Felhasználás előtt a lehűtött száraz anyagot üvegtartályban, fénytől és nedvességtől védve tároljuk. Uteroevakuáns hatóanyagok elkülönítése: A korábban ismertetett módon előállított 505 mg félig tisztított uteroevakuáns anyagkeveréket 2 ml benzolban oldjuk, és az oldatot 25 g 10% ezüstnitráttal impregnált kovasavval töltött oszlopra (belső átmérő: 20 mm, magasság: 15,5 cm) visszük fel. Az oszlopot nitrogén-atmoszférában, csökkentett (0,49 atmoszféráig terjedő) nyomáson növekvő mennyiségű acetont tartalmazó aceton-benzol elegyekkel eluáljuk. összesen 71, egyenként 25 ml térfogatú frakciót fogunk fel. Az eluáláshoz a következő oldószer-elegyeket használjuk fel: Frakció száma össztérfogat, ml Oldószer-elegy 1-18. 450 5 :95 arányú aceton-benzol elegy 19-28. 250 7 :93 arányú aceton-benzol elegy 29-38. 250 10 :90 arányú aceton-benzol elegy 39-71. 825 12-88 arányú aceton-benzol elegy A frakciók összetételét vékonyrétegkromatográfiás elemzéssel (adszorbens: 20% ezüstnitráttal impregnált GF szilikagél, eluálószer: 1 :1 arányú aceton-benzol elegy vagy 1 :30 :50 arányú izopropanol-aceton-kloroform elegy), « valamint gázkromatográfiás elemzéssel (3% OVI 7 /I : 1 arányú metilszilikon-fenilszilikon elegy / oszlop, 150—250 °C) vizsgáljuk. A 33—39. frakciót egyesítjük, és az oldószert lepároljuk. 73,3 mg (14,5%) olajos maradékot kapunk, amelynek spektrum-adatai a következők: Infravörös spektrum (hígítatlan minta): 2,90, 5,96 és 6,21 p. NMR-spektrum (CDC13, TMS): 6,11, 5,48, 4,25, 4,13, 3,56, 2,11, 2,08, 1,48, 1,13 és 1,01 ppm. A 45-56. frakciót egyesítjük, és az oldószert lepároljuk. 122,7 mg (24,2%) olajos anyagot kapunk, amelynek spektrum-adatai a következők: Infravörös spektrum (hígítatlan minta): 2,91 és 5,88 p i NMR-spektrum (CDC13, TMS): 5,41, 4,26, 4,15, 3,58, 3,18, 2,18, 1,76, 1,67, 1,15 és 1,04 ppm. A hatóanyagok méhösszehúzó hatását a következő módszerrel vizsgáljuk: Nemileg érett nőstény New Zealand nyulakat nátrium-pentobarbitállal altatunk, és az állatok petefészkét eltávolítjuk. 1 hetes gyógyulási idő elteltével a nyulaknak szubkután 6 napon át napi 5 pg 170-ösztrádióit, majd 7 egymást követő napon át szubkután napi 1,0 mg progeszteront adunk be. Az utolsó progeszteron-dózis beadását követő 72 óra elteltével a nyulak méhét és petevezetékét perfundáljuk- A perfúziót Heilman és munkatársai módszerének (Fertil. Steril. 23, 221) kissé módosított változata szerint végezzük. A petevezetéket és a méhet 53 pl/perc sebességgel perfundáljuk. A méh perfundálására szolgáló csövet a petevezeték végétől 1,0 cm távolságig a méhüregbe vezetjük. A méhet a méhkürt-csatlakozásnál lekötjük. A vaginát kissé bemetsszük, és a perfúziós folyadék összegyűjtése 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
