174299. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kérődzők tápanyaghasznosításának fokozására alkalmas A-28 086 jelű antibiotikum A vagy D jelű összetevőit tartalmazó szarvasmarha-takarmány előállítására
27 174299 28 5. Benzol és etil-acetát, 1 :1 6. Etil-acetát 7. Metanol Egy liter térfogatú frakciókat gyűjtünk. Mindegyik frakciót az eluált vegyületek meghatározására Bacillus subtilis-szel szemben mérjük, és vékonyrétegkromatográfiásan vizsgálunk. Az A 28 086 A és D a benzol és etil-acetát 7:3 és 1:1 arányú elegyével eluálódik, a 119-156. frakciókban. Ezeket a frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A desztillációs maradékot 500 ml acetonban oldjuk. 500 ml vizet adunk az acttonos oldathoz, híg hidrogénklorid oldattal 3-ra állítjuk be az elegy pH-ját, és egy órán át keverjük. Szűréssel elkülönítjük a kivált csapadékot, és 500 ml aceton és 180 ml víz elegyéből kikristályosítjuk. Szűréssel elkülönítjük a kristályokat, és csökkentett nyomáson szárítjuk, amikor 20,1 g, A és D komponenseket tartalmazó A 28 086 komplexet kapunk. 20. példa Az A 28 086 A és D komponensek elkülönítése és tisztítása. A 19. példában megadott eljárással előállított, A és D komponensekből álló, 18,8 g súlyú A 28 086 komplexet 50 ml benzolban oldjuk. Az oldatot 7x100 cm méretű, szilikagélből (E. Merck, grade 60, 230 mesh-nél finomabb) készült kromatografáló oszlopra öntjük. Az oszlopot 90 ml/óra sebességgel a következő sorrendben a következő oldószerekkel eluáljuk: 1. 12 liter benzol 2. 12 liter 9 :1 arányú benzol és etil-acetát elegy 3. 12 liter 4 :1 arányú benzol és etil-acetát elegy 4. 32 liter 7 :3 arányú benzol és etil-acetát elegy 5. 10 liter metanol. Az elúció követését B. subtilis bioautográfiával kapcsolt cellulóz vékonyrétegkromatográfiával (alumíniumoxid alapú Merck, Darmstadt cellulóz) végezzük. A vékonyrétegkromatográfiához a következő oldószerelegyet használjuk: víz, metanol és etil-acetát = 12:3:1, az elegy pH-ját először ammóniumhidroxiddal 10,5-re, majd hidrogénkloriddal 7,5-re állítjuk be. 1-2 liter térfogatú frakciókat gyűjtünk, míg az antíbiotikus aktivitás megjelenik, ezután 200 ml-es frakciókat szedünk. A csak A 28 086 D-t tartalmazó frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson desztilláljuk. A száraz desztillációs maradékot aceton és víz 1 :1 arányú elegyéből Idkristályosítjuk, a kristályokat elkülönítjük, és csökkentett nyomáson szárítjuk. Így 140 mg kristályos A 28 086 D-t kapunk. Az A 28 086 D-t nyomnyi mennyiségű A 28 086 A-val együtt tartalmazó frakciókkal szintén a fentiek szerint, járunk el, amikor további 150 mg kristályos, kevés A 28 086 A-t tartalmazó A 28 086 D-t kapunk. Szintén a fentiek szerint járunk el a csak A 28 086 A-t tartalmazó frakciókkal, amikor 4,7 g kristályos A 28 086 A-t kapunk. 21. példa Az A 28 086 komplexek előállítására a 16. példában megadott eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a törzset a következő összeté telű ferdeagaron tartjuk fent. Húskivonat 0,20% Dextrin 2,00% Élesztőkivonat 0,20% Enzimesen hidrolizált kazein 0,40% Kobaltklorid-hexahidrát 0,002% Agár 2,00% Desztillált víz 100 ml-re A táptalaj "pH-ját káliumhidroxiddal 7,0-re állítjuk be, és oltás után 7 napon át 28 °C hőmérsékleter inkubáljuk a tenyészetet. 22. példa Az A 28 086 komplexek előállítására a 17. példában megadott eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a következő összetételű rázott/termelő táptalajt használjuk: Tápióka dextrin* 8,00% Enzimesen hidrolizált kazein** 1,50% Melasz 1,50% Kalciumkarbonát 0,20% Ammóniumszulfát 0,10% Magnéziumszulfát 0,05% Finomitott szójaolaj 0,46% *Staley Dextrin No. 11, A. E. Staley Co-, Decatur, ül. **Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wise. 5 10 15 20 25 30 35 4C 45 50 55 60 S5 14
