174263. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szerin proteázok meghatározására, valamint a meghatározáshoz használható kromogén enzim-szubsztrátok előállítására
7 174263 8 vékonyrétegkromatogranxjn (Pj futtatóeleggyel futtatva) homogén anyagnak bizonyult, amelynek Rf értéke 0,22. [a]^4 --34° (c = 1,0, metanol). 1c) Cbo-Ileu-Glu(gamma-OBzl)-Gly-Arg(N02)-pNA (M = 862,9) 1,08 g (1,5 mmól) Ib) jelű vegyületet feloldunk 10 ml TFA-ban. Az oldatot egy órán át keverjük szobahőmérsékleten, azután erőteljes keverés közben lassan hozzáadjuk 75 ml vízmentes éterhez. Az éteres fázist dekantáljuk, a visszamaradó szemcsés maradékot újból kétszer 50 ml éterrel mossuk. A maradékot foszforpentoxidon és granulált káliumhidroxidon vákuumban 30 °C-on megszárítjuk. A tripeptid-származék TFA-sóját kapjuk csaknem kvantitatív hozammal 1,08 g mennyiségben. A termék az A eleggyel futtatva homogénnek bizonyult a vékonyrétegkromatogramon. Ezt a terméket 20 ml DMF-ban oldjuk. Az oldatot —10°C-ra hűtjük le és 0,23 ml trietilaminnal semlegesítjük. Ezután hozzáadunk 0,65 g (1,68 mmól) Cbo-Ueu-OpNP-t, és az oldatot lassan szobahőmérsékletig hagyjuk felmelegedni. FIárom óra múlva az oldatot újra lehűtjük —10°C-ra és 0,12 ml trietilaminnal pufferoljuk. A pufferolást 2—3 óra múlva megismételjük, azután az oldatot egy éjszakán át állni hagyjuk. A Cbo-Ueu-OpNP feleslegét 100 mg (mintegy 1,4 mmól) n-butilamin hozzáadásával elbontjuk. (Az aktív észter fölöslege nem kívánatos, mert nehéz elválasztani a tetrapeptidtől gélszűréssel.) Mintegy 30 perc múlva az oldatot vákuumban 40 °C-on bepároljuk. Sűrű olaj marad vissza, amelyet három részletben mosunk desztillált vízzel. Ezután metanolban oldjuk és gélkromatográfiával tisztítjuk egy SEPHADEX LH-20 adszorbenssel töltött, metanollal telített oszlopon. 1,07 g (83%) lc) jelű vegyületet kapunk, amelyet P, futtatóeleggyel futtatunk a vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során. A kromatogram szerint az anyag homogén, Rf értéke 0,35. [a]^4 -32° (c = 0,3, 95 : 5 térfogatarányú metanol-dimetilformamid elegy.) ld) Bz-Ileu-Glu(gamma-OBzl)-Gly- Arg(N02)-pNA 260 mg (0,30 mmól) Ic) jelű termékből a benziloxikarbonil-csoportot az la) példa szerinti módon eltávolítjuk. A kapott terméket A jelű futtatóeleggyel futtatjuk, és ekkor egy 0,45 és egy 0,60 Rf értékű foltot kapunk a vékonyrétegkromatogramon. Az infravörös spektrum szerint a termék H-Ileu-Glu(gamma-OH)-Gly-Arg(N02)-pNa • HBr és HBr • H-Ileu-Glu(gamma-OBzl)-Gly-Arg(N02)-pNA• HBr keveréke. Ezt a keveréket 800 mg (0,35 mmól) benzoesavanhidriddel reagáltatjuk az la) példa szerinti módon. A nyers benzoilezett terméket egy SEPHADEX LH-20 adszorbenssel töltött, metanollal telített oszlopon tisztítjuk. Két frakciót kapunk, amelyeket a és ß jellel jelölünk. Az a-termék mennyisége 130 mg, [a]p° -15° (c = 0,5, metanol Rf = 0,20 P! jelű futtatóeleggyel futtatva. A ^•termék mennyisége 105 mg, [a]^4 -11° (c = 0,5, acetonitril, Rf = 0,06 P, jelű futtatóeleggyel futtatva. Az infravörös spektrum szerint a két frakció Bz-Ileu-Glu(gamma-OBzl)-Gly-Arg(N02 )-pNA, illetve Bz-Ileu-Glu-Gly-Arg(N02)-pNA. (hidrogénfluoriddal való reakció során mindkét frakció ugyanazzá a végtermékké, le) jelű anyaggá alakul). le) Bz-Ileu-Glu-Gly-Arg-pNA • HC1 (M = 734,3) 100 mg (0,12 mmól) a-jelű frakciót (az Id) jelű termékből) és 0,5 ml anizolt betöltünk egy SAKAK1B ARA-készülék [Bui. Chem. Soc. Japan 40, 9 2164—2167, (1967)] reakcióedényébe. Az edénybe 5 ml vízmentes hidrogénfluoridot desztillálunk és 75 percig reagáltatjuk keverés közben 0 °C hőmérsékleten. Ezután a hidrogénfluoridot csökkentett nyomáson kidesztilláljuk, és az olajos maradékot 10 ml 33%-os vizes ecetsavban oldjuk, és egy SEPHADEX G—15 adszorbenssel és 33%-os vizes ecetsavoldattal töltött oszlopon kromatografáljuk. A tiszta, védőcsoporttól mentes tetrapeptid-származékot tartalmazó frakciót liofllizáljuk. A kapott vegyületet 95 :5 arányú metanol-desztillált víz elegyben oldjuk, és egy gyengén bázisos a OAE-SEPHADEX A-25 típusú ioncserélőn (klorid forma) kromatografáljuk az imént említett oldószerelegyből álló eluálószerrel. A metanolt 30 °C-on, csökkentett nyomáson eltávolítjuk az eluátumból, a visszamaradó vizes oldatot liofllizáljuk. 75 mg (85%) terméket kapunk, amely A jelű futtatóelegygyel futtatva homogén anyagnak bizonyult a vékonyrétegkromatogramon. Rf = 0,48 [ajp4 -40° (c = 0,5, 50% ecetsav deszt. vízben). Aminosavanalízis: lieu: 0,98, Glu: 0,95, Arg: 0,98, Gly: 1,00. 2. példa H-Ileu-Glu-Gly-Arg-pNA • 2HC1 Ha) H-Ileu-Glu-Gly-Arg-pNA • 2HC1 (M = 666,6) 100 mg (0,116 mmól) Ic) jelű vegyületet hidrogénfluoriddal reagáltatunk, majd tisztítjuk és ioncserélő gyantán kezeljük a terméket az le) példa szerinti módon. 56 mg (73%) terméket kapunk, amely az A futtatóeleggyel futtatva homogénnek bizonyult a vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során. Rf 0,34. [a]p4 -35° (c = 0,5, 50% ecetsav, deszt. vízben). Aminosavanalízis: lieu: 0,96, Glu: 0,94, Arg: 0,96, Gly: 1,00. A fenti példákban leírt szubsztrátokat az Xa faktor meghatározására használtuk az alábbiak szerint. A meghatározás azon az elven alapult, hogy az enzimatikus hidrolízis után kapott termék ultraibolya spektruma teljesen eltérő a kiindulási szubsztrát ultraibolya spektrumától. így az I. példa szerinti szubsztrát, a Bz-Ileu-Glu-Gly-Arg-pNA ‘ HC1 abszorpciós maximuma 315nm-nél van, moláris extinkciós koefficiense 12 000. A szubsztrát abszorpciója jelentéktelen 405 nm-nél. A p-nitroanilin (pNA), amely e szubsztrátból enzimatikus hidrolízis 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 5í 60 65 4
