174258. lajstromszámú szabadalom • Eljárás liposzómák vizes diszperziójának előállítására
3 174258 4 folyadékba, káliumklorid oldatba injektálják, amikoris liposzómák szuszpenziója képződik. A liposzómákat azután ultraszűréssel kell elkülöníteni, majd Sephadexen való kromatografálással tisztítani. E módszernek ugyanaz a hátránya, mint az eddig ismertetett módszereknek, nevezetesen az, hogy az eredeti vizes folyadéknak csupán egy kis része kapszulázható be az eljárással. A kiindulási vizes folyadék legnagyobb részét ugyanis szuszpendáló közegként használják az eljárásban. Clinical Science and Molecular Medicine című folyóirat 1975. évf. 49. számának 99. oldalán található közlemény liposzómák előállítási eljárását és az így kapott liposzómák biológiai vizsgálatát ismerteti. A liposzómákat úgy állítják elő, hogy az edény falán lipoidfilmet alakítanak ki az edénybe bevitt lipoid oldat forgó bepárlóban való bepárlásával. Az edénybe betöltik a bekapszulázandó anyagok: az albumin, aktinomicin D és 5-fluoruracil vizes oldatát, amikoris spontán képződik a liposzómák diszperziója. Egy másik kísérleti változatban az így kapott diszperziót ultrahang-frekvenciás rezgéssel kezelik, amikoris néhány nagyságrenddel kisebb mikrokapszulákat tartalmazó liposzó na-diszperzió képződik. Mindkét terméket patkányok heréjébe injektálták, és megvizsgálták a hatóanyag felszabadulását. Azt tapasztalták, hogy az ultrahangos kezelés nélkül készült liposzómákból a hatóanyagok késleltetve szabadulnak fel, ezzel szemben az ultrahangos kezeléssel készült liposzómákból az albumin normálisan, az aktinomicin D fokozottan szabadult fel. Az ultrahangos kezelés nélkül készült nagy liposzómákba bevitt albumin csak a liposzómák lipidjéből való felszabadulás után távozik a heréből, míg az ultrahangos kezeléssel kapott kis liposzómákból mind a három hatóanyag a liposzóma lipidjével együtt szabadul fel. Az ismert eljárások közös hátránya, hogy nem teszik, lehetővé a bekapszulázandó anyag elfogadható mennyiségének bevitelét a liposzómákba. Ezekhez az eljárásokhoz a bekapszulázandó folyadékmennyiségnél jóval nagyobb kiindulási folyadékmennyiségre van szükség. Az említett eljárások végrehajtása során ugyanis kolloid rendszerek jönnek létre ahol a liposzómák a kiindulási folyadéknak a kapszulákon kívül rekedt frakciójában vannak diszpergálva. A bekapszulázott folyadék térfogata a kiindulási folyadék térfogatának általában 1— 10%-át teszi ki. Értékesebb anyagot tartalmazó kiindulási oldat esetén tehát (többnyire ugyanis biológiailag aktív vegyületek oldatát kapszulázzák) a kívülrekedt frakciót vissza kell nyerni, hogy ismét fel lehessen használni az eljárásban. A kívül rekedt folyadékot úgy nyerik vissza, hogy elválasztják a liposzómáktól, tisztítják, majd újra beállítják az aktív vegyület koncentrációját. Az említett műveletekhez ugyanis kisebb-nagyobb oldószermennyiséget kell használni, így az oldat koncentrációja megváltozik. Az említett tisztítási és koncentrációbeállítási műveletek nehézkessé teszik a liposzómák eddig ismert előállítási eljárásait, aminek következtéjén azok alig használhatók az ipari gyakorlatban. A találmány célja, hogy iparilag is alkalmazható eljárást biztosítson liposzómák előállítására, amely mentes az előbbi hátrányoktól, biztosítván a teljes kiindulási folyadékmennyiség átalakítását. Azt találtuk, hogy a kitűzött célt oly módon érhetjük el, hogy egy biológiailag aktív vegyület vizes oldatát vagy diszperzióját egy poláris hidrofil és apoláris hidrofób csoportokat tartalmazó vegyület, előnyösen egy lipid, vagy ilyen vegyületek keverének jelenlétében ultrahang-frekvenciás rezgés segítségével egy a vízben egyáltalán nem vagy gyengén oldható, a víznél kisebb fajsúlyú szerves oldószerben diszpergálunk, az így kapott diszperzióval és vízzel vagy egy szerves vagy szervetlen vegyület vizes oldatával heterogén rendszert képezünk, amelynek felső fázisát a diszperzió, alsó fázisát a víz vagy vizes oldat foglalja el, és a felső fázisban diszpergált anyagot a heterogén rendszer centrifugálásával az alsó fázisba juttatjuk. Az eljárás tehát két lépésből áll. Az első lépésben ultrahang-frekvenciás rezgéssel diszperziót készítünk a bekapszulázandó folyadékból. A diszperzió kolloidális méretű. 200—1000 Â átmérőjű gömböcskéket tartalmaz a vízben alig vagy egyáltalán nem oldható folyadékban diszpergálva. Ezeket a gömb öcskéket egy poláris hidrofil és apoláros hidrofób csoportokat tartalmazó vegyületből álló monomolekuláris hártya határolja, amelyben a hidrofil csoportok a gömböcskék belseje, vagyis a vizes folyadék felé, a hidrofób csoportok pedig a gömböcskék külseje, vagyis a nem-vizes folyadék felé fordulnak. Ezek a gömböcskék szigorúan véve még nem liposzómák, minthogy külső faluk a poláris hidrofil és apoláris hidrofób csoportokat tartalmazó vegyületnek nem bimolekuláris, hanem csupán monomolekuláris rétege. Ezek a gömböcskék azonban mégis kezdeti formái a későbbi liposzómáknak, minthogy mindegyik magában foglalja már a végső liposzómában rejlő folyadékmennyiséget. Ezért ezeket a gömb öcskéket a továbbiakban liposzóma-prekurzoroknak nevezzük. A bekapszulázandó folyadék, a vízben alig vagy egyáltalán nem oldható folyadék és a poláris hidrofil és apoláris hidrofób csoportokat tartalmazó vegyület arányainak helyes megválasztásával elérhető, hogy az eljárással a kiindulási bekapszulázandó folyadék teljes mennyiségét be vigyük a liposzóma-prekurzorokba. A találmány szerinti eljárás tehát lehetővé teszi, hogy elkerüljük a kiindulási folyadék visszanyerését, tisztítását és koncentrációjának beállítását. E műveletekre, mint fentebb említettük, a korábbi ismert liposzóma-előállítási eljárásokban feltétlenül szükség van. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi továbbá igen kis folyadék mennyis égek kapszulázását is. így például 0,05-0,1 ml nagyságrendű kiindulási folyadékmennyiségből is készíthetünk liposzómát a találmány szerinti eljárással. Ilyen kis mennyiségű folyadékkal nem lehetett liposzómákat előállítani a korábban ismert eljárásokkal. A találmány szerinti eljárás tehát olyan újabb területeken, így például a laboratóriumi kutatások vagy az analízis területén is használható, ahol a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
