174189. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nem-vas komponens elválasztására a globintól vértartalmú folyadékokban
3 174189 4 nehezen valósítható meg. Az extrakciós eljárásnál oldószerként metiletilketont (Laboratory Methods in Porphyrin and Metalloporphyrin Research, Jürgen-Hinrich Fuhrhop, Kevin M. Smith, Elsevier Scientific Fubliching Company 1975. 52. oldal, Biochimica et Biophysica Acta 35, 543, (1959)/, acetont /Journal of Biological Chemistry 239, (11) 3699-3705, (1964), Journal of Food Science Volume 40, 155, (1975)/ vagy dimetilformamidot alkalmaznak. Az acetonos extrakdó üzemi méretben is ismert /Journal of Food Science Volume 40, 155, (1975)/, azonban az így kapott globin a benne maradt mérgező oldószer-maradványok miatt fogyasztásra alkalmatlan. Ha az acetont eltávolítják, úgy ez tönkreteszi a globint, amely elveszíti textúráit jellegét és alkalmatlanná válik élelmezési és takarmányozási célra. A találmány szerinti eljárás segítségével - mint láttuk - elválaszthatjuk a hem-vas-komponenst a globintól könnyen szeparálható agglomerátum képzése útján, míg a globin az oldatban marad. A vastartalmú agglomerátum elválasztása után a globint kicsaphatjuk és centrifugálással izolálhatjuk. Kiindulási anyagként használhatjuk magát a vért, a vörös vérsejteket, vagy a vérből nyert hemoglobin-oldatot. A hemoglobin-oldatot az 1. példában megadott módon állítjuk elő. A hem-vas-agglomerátum képzését előnyösen ♦10----20 °C hőmérsékleten hajthatjuk végre, de célszerűen 0 °C alatti hőmérsékletet alkalmazunk. A lehűtött oldathoz etanolt, metanolt, ezek elegyét vagy etanol illetve metanol és glikol illetve glicerin elegyét adjuk. Az alkohol mennyisége legalább 40, de előnyösen legalább 7 súlytérfogat%, az oldat teljes térfogatára számítva. Az oldószer hozzáadása után az oldat pH-ját 4,5 alá, előnyösen 2,5—4,5 pH-értékre állítjuk be szervetlen vagy szerves savak vizes oldatai, előnyösen sósav-, kénsav-, ecetsav- vagy citromsavoldat alkalmazásával. A fent megadott körülmények közt kapjuk az intenzív fekete színű, a globint oldott formában tartalmazó folyadéktól könnyen elválasztható hem-vas-agglomerátumot. Az agglomerátum képződéséhez feltétlenül szükséges a legalább 40 térfogat'/'-nyi fenti alkoholok jelenléte, melyek dehidratáló tulajdonságuk révén elősegítik a könnyen elválasztható agglomerátum képződését. Nem célszerű megfordítani az eljárási lépéseket, azzal először savanyítással megbontani a hemoglobint és utána hozzáadni a legalább 40 térfogat%-nyi alkoholt, mert így az oldatban finoman diszpergált hem-vaskomponens képződik, amely nem választható el könnyen az oldattól. A képződött hem-vas-agglomerátum tartalmazza az úgynevezett hem-vas-komponenst, továbbá fehérjéket, lipoproteineket, plazmafehérjéket és kis mennyiségű globint. Hem-vas-komponensnek nevezzük a hemoglobinnak a találmány szerinti eljárásban leírt körülmények közötti bomlása folyamán képződő vastartalmú anyagot. Ennek vastartalma túlnyomórészt a hemoglobin ferroprotoporfirinjéből származik. A vas kis része azonban más formában, például a hemoglobin mindig jelenlevő bomlástermékeiben vagy a transzferrin nevű vérfehérje alkotórészeként van jelen már a kiindulási anyagban. Valószínűleg az ilyen formában jelenlevő vas is leválik, azonban mennyisége elhanyagolható a hemoglobin bomlásából származó vasé mellett. A fekete agglomerátumban tehát a vas főleg hemin, illetve kis mennyiségben a hetnin bomlástermékei formájában van jelen. A találmány szerinti eljárással a kiindulási anyag hemoglobinjában levő vasnak több, mint 95%-a leválasztható. A hem-vas-agglomerátum képződését feltételezhetően az a kétfázisú rendszer teszi lehetővé, amely a magas alkohol-tartalom és a hidrofób és hidrofil tulajdonságokkal egyaránt rendelkező proteinek és lipoproteinek jelenléte hatására jön létre. Az agglomerátum fő alkotórésze egy komplex, mely protein molekulához, például denaturált globinhoz kötött több hem-vas-komponensből áll. A hem-vas-komponens feltételezhetően a proteinben levő hisztidin csoportokhoz kötődik főképpen ionos kötéssel. A kémiai kötés létét támasztja alá az a tény, hogy a hem-vas-komponens nem választható el az agglomerátumtól mechanikusan, például gélszűréssel. Az agglomerációt hatékonyabbá tehetjük sók, például nátriumklorid, káliumklorid vagy nátriumcitrát adagolásával. Ezek az anyagok kisózó hatásuk révén segítik a nagyobb és stabilabb agglomerátum gyorsabb képződését. A kisózó anyag mennyisége a reakcióelegy teljes súlyára számítva legfeljebb 8 súly%. Ennél több só hozzáadása már a globin kicsapódását is eredményezheti. A sót vizes oldata alakjában adagoljuk a reakciód egybe- A kapott agglomerátumot előnyösen centrifugálással izoláljuk. Az a tény, hogy az agglomerátum elválasztására 9000 g gyorsulású üzemi centrifugák és szabvány üzemi szűrők használhatók, lehetővé teszi az eljárás nagyüzemi megvalósítását. A centrifugán kapott felülúszóhoz a fentemlített alkoholok valamelyikét adagoljuk az első hozzáadásnak megfelelő mennyiségtől annak négyszereséig terjedő mennyiségben. Ennek az oldószernek az a szerepe, hogy a hem-vas-komponens csekély viszszamaradt részét oldott és/vagy finoman diszpergált formában tartsa. Az oldatból a globint ionerősség-növelc és/vagy dehidratáló anyagok alkalmazásával kicsapjuk. Erre a célra például nátriumklorid, nátriumszulfát, ammóniumszulfát, nátriumbenzoát vizes oldatát vagy poliglikolt használhatunk. Legelőnyösebb ammóniumszulfáíot alkalmazunk. A lecsapott globin világos szürke színű, és centrifugálással izolálható. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal kívánjuk közelebbről bemutatni. 1. példa A kiindulási anyagként használt hemoglobin-oldatot a következőképpen állítjuk elő: frissen levágott állatok véréből nátriumcitrát antikoaguláns alkalmazásával készített vörösvérsejt-oldatot etilalkohollal és vízzel kezelünk a sejtfal szét roncsolása céljából. A sejtfal maradékát centrifugálással eltávo-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
