174160. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kristályos inzulinból és oldott dez-fenilalanin-inzulinból álló antidiabetikus-inzulin-kombináció előállítására
5 174160 6 formájában. Ehhez az inzulin-oldathoz 250 ml, 0,95% jégecetet és 2,8% nátriumkloridot tartalmazó oldatot adunk. A tiszta elegyet ezután steril szűrésnek vetjük alá membránszú'ró'n keresztül, és az oldatot így csíramentesítjük. A steril, szűrt oldat pH-értékét steril 4 n nátriumhidroxid-oldat segítségével beállítjuk 5,4-5,8-re. A kapott amorf inzulin-szuszpenziót rövid ideig steril körülmények között szobahőmérsékleten keverjük és ezután hűtőszekrényben +4 °C és +7 °C hőmérsékleten kristályosodni hagyjuk. Maximum 36-40 óra múlva egyenletes romboéderes, egységes, 15-35 ju méretű kristályok képződnek. A kristályokat steril csövekben alacsony fordulatszám mellett centrifugáljuk, és így az esetleg még jelenlevő kismennyiségű amorf részt elválasztjuk. A centrifugált kristályokat ezután 7 liter steril, pufferolt semleges inzulint-hígító-oldatban (összetételét lásd: I. táblázatban) újból szuszpendáljuk (alapszuszpenzió). I. táblázat Az inzulint-hígító-oldat összetétele: « 10 liter oldat tartalmaz: B) Oldott komponens, uez-fenílalanin®'-marha-inzulin-oldat előállítása 6,304 g kristályos dez-fenilalaninB1-marha-in- 5 zulint feloldunk 3,5 liter, a II. táblázatban megadott összetételű oldófolyadékban. II. táblázat 10 A dez-fenilalanin®1 - marha-inzulin oldófolyadékának összetétele: 5 liter oldat tartalmaz: 15 5 g 4-hidroxi-benzoesav-metilésztert 2,85 ml ecetsavat, amely nátriumacetát- 2o trihidrátból eredményez 37,5 g nátriumkloridot 25 21 mg (vízmentes) dnkkloridot = 0,1%-t = 0,14%-t = 0,75%-t = 2,0 meg Zn^/ml 10 g 4-hidroxi-benzoesav-metilésztert = 0,1%-t 14 g nátriumacetát-trihidrátot = 0,14%-t 75 g nátriumkloridot = 0,75%-t 105 mg cinkklorid (ZnCl2)-t = 5,0 meg Zn^/ml-t nátriurnhidroxid-oldatot pH 6,9 értékig. Az oldatot sterilen szűrjük. Az alapszuszpenzió kristályos inzulin-tartalmának a meghatározása 5 ml 4 n sósav-oldatot. 30 A dez-fenilalaninB 1-inzulin tiszta oldatát ezután membránszűrő segítségével csíramentesítjük és hozzáadunk 400 ml fenti ugyanazon a sterilező szűrőn átfolyatott fenti oldófolyadékot és így az oldat térfogatát 3,9 literre állítjuk be. 4 n steril nátrium- 35 hidroxid-oldat hozzáadásával (körülbelül 13 ml) a pH-értéket 6,9-re állítjuk be. 34 ml steril semleges inzulint-hígító-oldat további hozzáadásával (összetételt lásd az I. táblázatban) a végső térfogatot 3,947 literre és az inzulin-tartalmat 401.E./ml-re 40 állítjuk be. A kapott dez-fenilalanin®1 marha-inzulin-oldat aktivitása 25 I.E./mg. C) Alkalmazásra kész készítmény előállítása Az alapszuszpenzió kristályos inzulin-tartalmának 45 meghatározásához a kristály-szuszpenzióból, mágneses keverő segítségével történő intenzív keverés után, négyszer, egyenként 10ml-t (teljes pipettányit) kiveszünk és az inzulin-tartalmat a következő módszerek szerint határozzuk meg: 50 1. Gravimetriásán acetonnal és éterrel történő szárítás és mérés után. 2. A kristályok feloldása után spektrofotometriás úton ultraibolya fényben 280 nm-nél. 55 3. A nitrogén-tartalom meghatározása útján. 40 I.E./ml-t tartalmazó depó-komponens előállítása 60 Az alapszuszpenzióban meghatározott inzulin-tartalom szerint ezt az értéket a steril nígitó-oldat további hozzáadásával a kívánt 40I.E./ml inzulin-tartalomia állítjuk be. így maximum 10 liternyit készítünk. 65 l.A) példa szerint előállított kristályos marha-inzulin-depó-komponenst az 1 .B) példa szerint előállított, oldott dez-íenilalaninB 1 -marha-inzulint tartalmazó komponenssel elegyítjük 80-20 térfogatarányban, a kapott készítmény 321.E./ml kristályos marha-inzulint és 8 I.E./ml oldott dez-fenilalanin®1 - -marha-inzulint, tehát összesen 40 I.E./ml inzulint tartalmaz. A szuszpenziót steril körülmények között 10 ml-es üvegekbe töltjük. 2 példa A) Kristályos sertés-inzulin-szuszpenzió előállítása lóg 15-35p nagysága marha-inzulin-kristályokat tartalmazó steril szuszpenziót — mely kristályokat pH 5.4-5,8 érteken az 1. példában leírtakkal analóg módon egy alkalmas pufferből kristdlyositottuiik . centrifugálunk. A felül úszó dekantáiása után a kr.st.ílyoka* 7 liter steril, pufferolt, 3
