174149. lajstromszámú szabadalom • Eljárás emberi albumin előállítására
7 174149 8 Az albumin frakció hatásos kivonására a polietilénglikolt savas közegben használhatjuk, célszerűen 4,5—5,6 pH tartományban, és 20-30% végső koncentrációban. Így az albumin kivonása a kezelt oldatból egyszerűen a polietilénglikol hozzáadásával történik, szükség szerint feleslegben történő hozzáadásával, hogy az oldat pH-ját a fent megadott értéken tartsuk. Hogy a hepatitisz vírus fertőzés veszélyét elkerüljük, az így készített albumin frakciót 60 °C-on 10 óráig hőkezeljük, megfelelő stabilizator jelenlétében. Az orvosi felhasználás szempontjából kívánatos, hogy a végtermékként csapadék formájában megkapott albumint dializálva eltávolítsuk a sókat és szűréssel a baktériumokat. A polietilénglikol tartalmat csökkenthetjük ha a csapadékot kissé savas pH-jú desztillált vízzel mossuk, ami kis koncentrációban polietilénglikolt is tartalmaz. így kis polietilénglikol tartalmú albumin-protein állítható elő. Szükség szerint az albumin-proteint a továbbiakban elektrodialízisnek vethetjük alá kedvező eredménnyel. Ezután a terméket a szokásos módon dehidratálva száraz, referencia standard készítményt kapunk. A találmány szerinti eljárás nem várt előnye, hogy nemcsak a csoportanyagokat távolítja el, hanem egyúttal a vérnyomáscsökkentő-anyag és a lázkeltő-anyagtartalmat is csökkenti, melyek esetleg a kiindulási anyagnak kísérői. Ezeket a szennyeződéseket a polietilénglikol hozzáadására képződő csapadék tartalmazza, és azzal együtt eltávolíthatók. Az elektroforetikus módszerrel történő analízis szerint (T. Kawai és N. Aoki, „Fractionation of serum proteins by cellulose acetate electrophoresis” 35, old., Yagi Publishing Co., Tokyo, 1972) az albumin referencia standard 95—98% albumint és 2-5% a-globulint és (3-globulint tartalmazott. Ultracentrifugálással történő analízis [T. Isemura és társai J. Biochem., Vol. 44, p. 443 (1957)], egyszeres csúcsot mutatott, ami tiszta proteint jelent. A csoportanyag tartalmat a hemagglutinációs gátlás vizsgálattal ellenőriztük vércsoport specifikus antiszérumot használva. Az antiszérum hígítási arány mérés (lásd 1. táblázat) azt mutatta, hogy a csoportanyagot olyan mértékben sikerült eltávolítani, hogy a normál sóoldatokhoz hasonló értéket kapunk. A vérnyomáscsökkentő anyag tartalmat úgy számítottuk ki, hogy az elkészített mintát felnőtt kutyának adagoltuk és mértük az adagolás előtti artériás nyomáshoz viszonyított vérnyomáscsökkenést. A százalékos vérnyomáscsökkenést legfeljebb 10%-nak találtuk, ami azt bizonyítja, hogy a minta az orvosi felhasználás szempontjából gyakorlatilag mentes a vérnyomáscsökkentő anyagoktól. Ahogy azt az előzőekben említettük, a találmány szerinti eljárással a csoportanyagok teljesen, és ugyanakkor gazdaságosan eltávolíthatók, a vérnyomáscsökkentő anyagokkal együtt. így tehát nagy hatásfokkal olyan plazma-proteint kapunk, amely többségében olyan albumint tartalmaz, amelynél nem kell félni a fent említett szennyezők által okozott mellékhatásoktól. A találmány szerinti eljárást a konvencionális módszerekkel kombinálva olyan albumin infúziós készítményeket állíthatunk elő, melyek a gyógykezelés szempontjából nagyon fontosak. A találmányt az alábbi példákkal illusztráljuk anélkül, hogy a találmányt csupán ezekre korlátoznánk. 1. példa Placentákat közvetlenül az eltávolítás után műanyag zsákba helyezünk és -20 °C-os hűtőszekrényben fagyasztva tároljuk. Ezeket a fagyasztott placentákat kórházakból és szülőotthonokból gyűjtjük össze. Az 1000 placentát tartalmazó műanyag zsákokat lázkeltő anyagoktól mentes desztillált vízzel külsőleg mossuk, majd durván összetöijük. A műanyag zsákot könnyen eltávolíthatjuk. A durván összetört fagyasztott placentákat húsdarálóval finomra őröljük. Körülbelül 600 kg finomra őrölt placentához 700 liter 1%-os sós vizet adunk. Az elegyet 12 °C alatti hőmérsékleten 45 percig keverve, a vér-komponenseket extraháljuk. Az extraktumokból centrifugálással eltávolítjuk a placenta maradványokat, majd a további feldolgozásra kerülő oldatot elkülönítjük (placenta extraktum). Az extraktum 3,5% összes proteint tartalmaz, ami 2,3% hemoglobinból és 1,2% egyéb plazma-proteinekből áll. A fenti extraktum 1 literéhez 285 g ammónium■szulfátot adunk és a keletkezett csapadékot, ami 7-globulint tartalmaz, eltávolítjuk. A hemoglobin, a csoportanyagok többsége és az albumin az oldatban marad. Minthogy az oldat proteintartalma kicsi, az összes proteint kivonhatjuk csapadék formájában, úgy, hogy 200 g ammóniumszulfátot adunk az oldathoz és a pH értéket 6-7 közé állítjuk be. Amennyiben lehetséges, a csapadékot dehidratáljuk, és csapadék kilogrammonként 4-7 liter lázkeltő anyagtól mentes desztillált vízben feloldjuk. Az ammónium-szulfát, ami a fenti előkezelés során a proteinhez kapcsolódva továbbra is az oldatban marad, függetlenül a mennyiségétől, nem zavarja további kezelést. Az így kapott oldathoz keverés közben addig adagolunk mandulasavat a szokásos módon, míg koncentrációja a 4%-ot el nem éri. 4,9—5 pH érték mellett az oldatot 58—60 °C-on tartjuk 1 óráig, mialatt a hőérzékeny proteinek kicsapódnak. Ezalatt a kezelés alatt a hemoglobin nagy része eltávolítható a hőérzékeny proteinekkel együtt, míg a csoportanyagok, vérnyomáscsökkentő anyagok és a lázkeltő anyagok az oldatban maradnak. Az oldatban levő protein 1,5% albumint tartalmaz. A csoportanyag és a vérnyomáscsökkentő anyagok eltávolításának érdekében az oldat protein koncentrációját 5—40 g/liter értékre állítjuk be, a sótartalmat pedig, nátríumklorid ekvivalensben kifejezve, legfeljebb 5%-ra. Az így kapott oldat 1 literéhez 6000-es átlagos molekulasúlyú polietilénglikolt adunk, és az oldat pH-ját 8,0-ra állítjuk be. így bizonyos proteinek kicsapódnak. A csapadékot eltávolítjuk, és a visszamaradt oldatban csak olyan proteinek maradnak, melyek fő alkotóként a kívánt albumint tartalmazzák. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
