174149. lajstromszámú szabadalom • Eljárás emberi albumin előállítására
3 174149 4 frakcionálással kombinálják (1 222 449 számú brit szabadalmi leírás). 6. Eljárás, amely szerint vajsavat adnak a frakcionált vér komponens oldathoz, rs az oldatot 5,0 körüli pH értéknél 60 °C-ra melegítik, míg a hemoglobin az instabil globulinokkal együtt kicsapódik, amit aztán eltávolítanak. (534 921 lajstromszámú japán szabadalmi leírás). 7. A frakcionált vér komponens oldathoz mandulasavat adnak és az oldatot 4,9-es pH-nál körülbelül 60 °C-ra melegítik míg az instabil globulin a hemoglobinnal együtt kicsapódik, ezeket a komponenseket elkülönítik. 8. A módszer szerint az oldat teljes mennyiségére vonatkoztatott 55% vagy ennél nagyobb etanol koncentrációnál, triklórecetsavat adva az oldathoz —5 °C és —10 cC közötti hőmérsékleten a csoport anyagok eltávolíthatók. (1 441 752 számú brit szabadalmi leírás és 3 992 367 számú USA szabadalmi leírás). Az 1., 2. és 3. módszer nem alkalmazható olyan esetben mint a placenta-vér, amely hemolízisen ment keresztül és nagy mennyiségű felszabadult hemoglobint és csoport anyagot tartalmaz, mert nem specifikusak a kicsapódott hemoglobinre és a csoportanyagokra. így az albumin nem különíthető el a csoport anyagoktól és a hemoglobintól. A 4. és 5. módszer nemcsak hogy nem gazdaságos az egyes lépések bonyolultsága és a frakcionálási műveletek miatt, hanem a gyúlékony alkohol alkalmazása, valamint az alacsony hőmérséklethez szükséges hűtés miatt kivitelezése is nehéz. A 6. és 7. pontban ismertetett folyamatot ugyan szobahőmérséldeien hajtják végre, és a hemoglobin gazdaságosan eltávolítható az emberi plazmából, mint például a placenta kivonatból, ami nagy mennyiségű hemoglobint tartalmaz, de a csoport anyagok eltávolítása ezzel a módszerrel nem lehetséges. A 8. módszer bizonyos mértékben lehetővé teszi a hemoglobin és a csoport anyagok eltávolítását, de a triklórecetsav alkalmazása miatt fennáll a protein denaturálás veszélye, minthogy a triklórecetsav protein denaturáló szer (kicsapószer). A módszer a biztonságos üzemeltetés miatt is problematikus, mert nagy koncentrációban alkalmaz gyúlékony alkoholt, és gazdaságtalan is, mert a -5 °C és — 10°C közötti hőmérsékleten való tartás miatt folyamatos hűtést igényel. A találmány tárgya egy gazdaságos és biztonságos eljárás az albuminok kivonására az emberi vérből, különösen olyan emberi vérből, amely felszabadított hemoglobint tartalmaz. Az ide vonatkozó tanulmányok valamint az eddigi ismeretek alapján egyszerű, biztos és gazdaságos módszert sikerült találni olyan emberi plazma proteinek kinyerésére, amelyek fő komponensként albumint tartalmaznak, és amelyeket az orvosi kezelésben biztonsággal lehet használni. Az emberi albuminok előállítására vonatkozó találmány szerinti eljárás lényege az, hogy vércsoport anyagot tartalmazó emberi placentából vagy retroplacentás vérből származó albumin vizes oldatához 6,6 és 9,6 közötti pH-nál a vizes oldat össztérfogatára számítva 13—30% (súlytérfogat) polietilénglikolt adunk, a kicsapódó szennyező proteineket, melyek az említett vércsoport anyagokat is tartalmazzák, elkülönítjük, és a visszamaradt oldatból az albumint kivonjuk. Kiindulási anyagként nagytisztaságú, vagy kismértékben tisztított és csoportanyagot tartalmazó, humán placentáris eredetű vagy humán retroplacentás vérből származó albumin egyaránt használható. Az ilyen oldat albumin-tartalma a teljes protein-tartalomra vonatkoztatva legalább 50%, de célszerűen 80%. Használhatunk albumin tartalmú vizes oldatot, melyet parciális hemolízisnek vetettünk alá, és amely csoportanyagokat és hipctenzív anyagokat együttesen tartalmaz, akár placenta kivonatból, akár retroplacentás vérből készült. A hemoglobin és az alkálikus foszfatáz eltávolítására vonatkozó előtisztítás abban áll, hogy a plazma protein vizes oldatát, melyet a 7-globulintől már előzőleg megtisztítottunk, 2—6 % (súly/térfogat) vajsav vagy mandulasav és 0,5—l,5mmól etiléndiamintetraecetsav (EDTA), de célszerűen ennek nátriumsója jelenlétében, 4,5—5,5 pH érték mellett 50—60 °C-ra melegítjük. A képződött csapadék eltávolítása után az anyag felhasználásra kész. A felhasználásra alkalmas polietilén-glikol molekulasúlya általában 2000—10000-ig terjed, bár a 4000—8000 molekulasúlyúak a leghatásosabbak. Ha a kiindulási anyagként használt vizes albumin oldathoz pH 6 és 10 között polietilén-glikolt adunk, csapadék képződik. A kiindulásul használt vizes oldat természetétől függően, a polietilénglikol végső koncentrációja a vizes oldatban 13 és 30% között van. Kedvező koncentráció 13-20% (súly/térfogat) 6,6—8,0 pH tartományban és 15—30% 8,0—9,6-os pH tartományban. A reagáló oldatban célszerű a protein koncentráció 5-40 g/literre beállítani. A szervetlen só nátriumklorid ekvivalensben kifejezett koncentrációját célszerűen 50g/íiterre vagy ennél kevesebbre állítjuk be. Mindenesetre, a proteinoldattal való óvatos bánásmód miatt, a reakciót alacsony hőmérsékleten kívánatos végezni, amennyiben ezt a fenti értékek megengedik. A fent leírt kezelésmód mellett az albumin alig csapódik ki, miközben a csoportanyagok, beleértve a glikoproteint is, kicsapódnak. Ha a szennyező proteinek, mint például a hemoglobin, a vérnyomáscsökkentő anyagok, például alacsony molekulasúlyú peptidek (1000—10000) és hasonlók vannak jelen, a csoport anyagokkal együtt ezek is lecsapódnak, és a vizes albumin oldattól elkülöníthetők. A csoportanyagok eltávolítására vonatkozó eljárás feltételeit összehasonlító kísérletekkel határozhatjuk meg, melynek során a polietilénglikol molekulasúlya, végső koncentrációja és a reakcióelegy pH-ja közötti összefüggéseket vizsgáljuk. Például, az 1% (súly/térfogat) proteint és sót (nátriumldoridban kifejezve) tartalmazó kiindulási vizes albuminoldatokat 4000 vagy 8000 átlagos molekulsúlyú polietilénglikollal kezelünk és változtatva a hozzáadott polietilénglikol mennyiségét és a reakcióelegy pH-ját a csoportanyagok eltávolítására különböző eredményeket kapunk, melyeket az I. táblázatban foglalunk össze. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
