174128. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkálifém- vagy ammónium-inzulin tisztítására gélszűréssel
3 174128 4 oldják, majd az inzulint ismét ldsózzák, ezúttal azonban az első kisózó lépésben alkalmazottnál kisebb sókoncentrációval. Egy harmadik ipari jelentőségű inzulin tisztító eljárás lényege abban áll, hogy az inzulint oldatból cink-inzulin komplex alakjában csapják ki vagy kristályosítják. A cink-inzulint általában cinkionokat tartalmazó pufferolt vizes oldatból csapják ki. E célra különféle pufferokat alkalmaznak, Petersen például a 2 626 228 lajstromszámú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás szerint citromsav-citrát puffért használt. A jelenleg az inzulin tisztítására iparilag alkalmazott eljárások jellegzetes módon a fent említett mindhárom módszert magukban foglalják. Minthogy a cink-inzulin az inzulin legfontosabb kereskedelmi alakja, az inzulin tisztítás utolsó lépése rendesen cink-kristályosító lépés. Az utóbbi években viszont felismerték, hogy a kereskedelmi cink-inzulinok kisebb mennyiségekben alkotókként nem-inzulin proteineket is tartalmaznak, amelyek között a leginkább túlsúlyban a proinzulin és a proinzulinszerű fehérjék vannak jelen. Jóllehet az ilyen Összetevők általában a kereskedelmi cink-inzulinok kevesebb mint 8 súly%-át teszik ki, úgy vélik, hogy ezen alkotók némelyike antigén vagy immunogén természetű. L. például erre vonatkozóan Chance és munkatársai, Science, 161, 165 (1968), Steiner és munkatársai, Diabetes 18, 725 (1968), Bromer, BioSdence, 20, 701 (1970), valamint Rubinstein és munkatársai, Ann. Rev. Med., 22, 1 (1971) közleményeit. Ezért tehát továbbra is élő probléma a nem-inzulin fehérjék ipari méretű eltávolítása az inzulinból. Az „inzulin” kifejezésen a leírásban végig nem csupán magát az inzulint értjük, és jelöljük, hanem valamennyi inzulinszerű fehérjét, így például a dezamino-inzulint is. Minthogy az inzulin és az inzulinszerű fehérjék vércukorcsökkentő hatása hasonló, rendszerint nem szükséges az inzulint minden más hasnyálmirigy fehérjétől elválasztani, azaz rendesen nem követelmény a homogén inzulin előállítása. A biológiai anyagok felbontására alkalmas analitikai léptékű módszerek, mint amilyenek például az elektroforézis és az ioncserélő kromatográfia jói ismertek arra célra, hogy velük a kereskedelmi (vagy éppen nyers) inzulin készítményekben elválasszuk az inzulintól a nem-inzulin alkotókat. Sőt, ezek a módszerek még arra is alkalmasak, hogy magát az inzulin komponenst felbontsák a tulajdonképpeni inzulinra és a dezaminált inzulinokra, nagyipari mértékben való alkalmazhatóságuk azonban erősen kérdéses. A nagyüzemi alkalmazás szempontjából könynyebben megvalósítható eljárást kínál a gélszűrés (a gél kizárásos kromatográfiával és a gél permeádós kromatográfiával szinonim kifejezés). E módszernél a fehérjéket oszlopon választják el. Az oszlop olyan gát tartalmaz, amelyet oly módon térhálósítottak, hogy minden egyes gélrészecskén belül pórusok alakulnak ki. E pórusoknak véges, mérhető térfogatuk van, amely egyenesen arányos a gél duzzadásának fokával és fordítottan arányos a térhálósítás mértékével. Minthogy a kisebb molekulák könnyebben juthatnak be a pórusokba mint a nagyobb méretű molekulák, a kisebb molekuláknak az áthaladása az oszlopon akadályozott, míg a nagyobb méretű molekulák a pórusokba csak részlegesen vagy egyáltalán nem juthatnak be. A gélszűrést a múltban már alkalmazták az inzulin tisztítására. Az inzulin macska hasnyálmirigyből történő elkülönítésénél a nyers inzulint oly módon állították elő, hogy azt sawal-alkohollal kivonatolták, az inaktív anyag eltávolítására kicsapták, besűrítették, izoelektromosan kicsapták, majd végül nátrium-kloriddal kisózták. Az így kapott nyers inzulint azután térhálósított dextrán gél oszlopra vitték és 1,0 mólos ecetsav oldattal eluálták [Davoren, Biochim. Biophys. Acta, 63, 150 (1962)]. Az inzulin halból történő elkülönítésénél a mirigyeket vízben homogenizálták és a fehérjéket triklór-ecetsav oldattal kicsapták. A csapadékot ezután sav-etilalkohol eleggyel kivonatolták és a kivonatokat a lipidek eltávolítása céljából metilén-dikloriddal kezelték. A visszamaradt szilárd anyagot elkülönítették és 5,0 mólos ecetsavval vették fel. Ezt az oldatot térhálósított dextrán gél oszlopon szűrték és arról 5,0 mólos ecetsav oldattal eluálták. [Humbel, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 12, 333 (1963)]. Ezzel a módszerrel 80% körüli hozamokról számolnak be. Említésre méltó, hogy Humber megállapítása szerint ahhoz, hogy az inzulin jól legyen elválasztható az egyéb fehérjéktől, olyan eluálási viszonyokat kell alkalmazni, amelyek elősegítik az inzulin mokekulák disszodálódását. Humbel azt is megállapítja még, hogy az 1,0 mólos ecetsav nem kielégítő oldószer, minthogy Yphantis és Waugh szerint [Biochim. Biophys. Acta, 26, 218 (1957)] ebben az oldószerben az inzulin nem disszociál tökéletesen. Epstein és munkatársai [Biochemistry, 2, 461 (1963) marha hasnyálmirigy nyers kivonatát szűrték térhálósított dextrán gélen. Az eluáló oldószer ez esetben a Humbel által a fent idézett munkájában ugyancsak elvetett 0,2 mólos ammónium-hidrogén-karbonát oldat volt. Epstein és munkatársai kb. 60%-os hozamról számolnak be. Inzulint még emberi hasnyálmirigyből is előállítottak. A mirigyeket előbb homogenizálták, majd kivonatolták. Ammónium-szulfátos frakdonálással bizonyos mennyiségű hatástalan anyagot eltávolítottak. Ezt követően előbb nátrium-kloriddal, majd izoelektromos kicsapással kicsapták az inzulint. A kapott inzulint 0,5 n ecetsav oldatban oldották és térhálósított dextrán gélen szűrték, végül a szűrt inzulint cink-inzulinná alakították [Jackson és munkatársai, Diabetes, 18, 206 (1969)]. Az inzulin hozam a gélszűrés után kb. 60%-os volt. Végül a gélszűrést és az ioncserélő kromatográfiát kombinálták Schlichtkrull és munkatársai a 69/5280 lajstromszámú délafrikai szabadalmi leírásban leírtak szerint (ennek megfelelője a 737 257 lajstromszámú belga szabadalmi leírás). A gélszűréssel foglalkozó egyetlen példájuk szerint (1. példa) a cink-inzulint térhálósított dextrán gfl oszlopon, 80%-os hozammal szűrték. Eluáló oldószer5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
