174077. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új dekapeptidamid származékok előállítására
9 174077 10 dékot 20 ml vízben feloldjuk, majd a vizes oldatot kétszer 10 ml etil-acetáttal extraháljuk. A vizes fázist ezután 2 cm-szer 33 cm méretű, karboximetilcellulózból készült oszlopra felvisszük, majd az oszlopot gradiens-eluálásnak vetjük alá 6,8 pH-jú 0,005 mólos és 0,2 mólos ammónium-acetát-pufferrel (500—500 ml). A 420 ml és 680 ml közötti frakciókat összeöntjük, majd liofilizáljuk, amikor is 380 mg mennyiségben fehér por alakjában a cím szerinti vegyületet kapjuk. Fajlagos forgatóképessége [a]o2 = -32,4° (c = 0,52, 5%-os vizes ecetsav), Rf1 = 0,05 és Rf = 0,68. Aminosav-elemzés: His 1,01, Arg 0,98, Trp 0,87, Ser 0,94, Glu 1,00, Pro 1,02, Gly 1,00, Nva 1,01, Leu 1,00, Phe 0,97 (peptidtartalom 84%). 2. példa (Pyr)Glu-His-T rp-Ser-Tyr-(D)-Nle-Leu-Arg- -Pro-Gly-NH2 előállítása szilárdfázisú reakcióban a) BOC-Gly-gyanta előállítása Kloroform és etanol 2 :1 arányú elegyéből 60 ml-hez 10 g klórmetil-gyantát [a Protein Research Foundation, Minő city, japán cég által forgalmazott, klórmetilezett polisztirolgyanta, klórtartalma 2,0 millimól/g], majd 10,5 g BOC-Gly-t és 8,4 ml trietil-amint adunk. A kapott keveréket először szobahőmérsékleten 1,5 órán át keverjük, majd 24 órán át 80—85 °C hőmérsékletű olajfürdőn visszafolyató hűtő alkalmazásával fenntartott enyhe forrást biztosítva tartjuk. A gyantát ezután kiszűrjük, dimetil-formamiddal, etanollal, vízzel, etanollal és dietiléterrel a felsorolás sorrendjében mossuk és szárítjuk. így 17,55 g gyantát kapunk. Aminosavra vonatkozó elemzésének tanúsága szerint a gyanta 0,88 millimól/g BOC-Gly-t tartalmaz. b) (Pyr)Glu-His(Tos)-Trp-Sei(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Nle--Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-gyanta előállítása. Automatikus peptidszintetizátor (gyártó cége a Simadzu Seisakusho K.K. japán cég, modelltípus APS—800) reakciótankjába bemérünk az a) lépésben kapott BOC-Gly-gyantából 2,177 g-ot, majd a gyantát diklór-metánnal 12 órán át duzzasztjuk. Ezután az alábbi aminosavakat tápláljuk be az alábbiakban ismertetett ciklus szerint: BOC-Pro, BOC-Arg(Tos), BOC-Leu, BOC-D-Nle, BOC-Tyr(Bzl), BOC-Ser(Bzl), BOC-Trp, BOC{His/Tos) és (Pyr)Glu. Diklór-metán (3-szor 3 perc) -* 50% trifluorecetsav/dikiór-metán (10 perc és 30 perc) -* diklór-metán (3-szor 3 perc) -> etanol (3-szor 3 perc) -*■ klorofom (3-szor 3 perc) -> diklór-metán (2-szer 3 perc) -»• BOC-aminosavanhidrid (BOC-aminosavból és DCC-ből ismert módon előállított) (30 perc és 60 perc) -*■ acetilezés (ecetsavanhidriddel diklór-metánban és trietil-aminban) (1 óra) -* diklór-metán (3-szor 3 perc). Csak a (Pyr)Glu-t kondenzáljuk közvetlenül DCC-vel dimetil-formamidban. Végül a gyantát etanollal, kloroformmal, dimetil-formamiddal és dietiléterrel mossuk, majd szárítjuk. így 6,20 g cím szerinti terméket kapunk. c) (Pyr)Glu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Nle-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH2 előállítása 50 ml, ammóniával telített metanolban a b) lépésben kapott gyantából 2,622 g-ot szuszpendá- Iunk, majd a szuszpenziót szobahőmérsékleten 70 órán át keverjük. A gyantát ezután kiszűrjük és dimetil-formamiddal mossuk. A szűrletet és a mosófolyadékot összeöntjük, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk és a kapott maradékot dietiléterrel eldörzsöljük. így 1,187 g por alakú nyers terméket kapunk. E nyers porból 588 mg-ot 50 g szilikagélből készült oszlopon kromatografálunk eluálószerként metanol és kloroform elegyét használva, amikor is az eluátum bepárlása után 186 mg cím szerinti vegyületet kapunk. d) (Pyr)Glu-His-T r p-Ser-Tyr-D-Nle-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 előállítása 5 ml vízmentes hidrogén-fluoridban feloldunk a c) lépésben kapott védett peptidből 173,3 mg-ot, továbbá 0,2 ml anizolt és 0,2 ml merkaptoetanolt, majd a kapott oldatot 0 °C-on 1 órán át keverjük. Az oldatot ezután csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, majd a maradékot 20 ml vízben feloldjuk. Az oldhatatlan rész kiszűrése után a szűrletet 1,5 cm átmérőjű és 20 cm hosszú, erősen bázisos anioncserélőgyantából (acetát-formájú Amberlite IRA-410 gyanta, gyártó cége a Rohm and Haas amerikai egyesült államokbeli cég) készült oszlopon átbocsátjuk. Az átfolyt folyadékot ezután 1,5 cmszer 22 cm méretű, karboximetilcellulózból készült oszlopra felvisszük, majd az oszlopot 6,8 pH-jú, 0,005—0,2 mólos ammónium-acetáttal gradiens-eluálásnak vetjük alá. A kapott eluátumot ezután felvisszük egy 1,5 cm-szer 7,5 cm méretű, Amberlite XAD-2 gyantából (gyártó cége ugyancsak a Rohm and Haas amerikai egyesült államokbeli cég) készült oszlopra, majd az oszlopot gradiens-eluálásnak vetjük alá 5—70%-os vizes etanollal. Az eluátumot további gélszűréses kromatografálásnak vetjük alá 0,9 cm-szer 53,5 cm méretű, Sephadex LH-20 márkanevű gyantából (gyártó cége a Pharmacia Fine Chemicals svéd cég) készült oszlopon, eluálószerként 0,1 n ecetsavoldatot használva, így végül a cím szerinti vegyületből 39 mg-ot kapunk. Fajlagos forgatóképessége [a]^4 = -40,5° (c = 0,5, oldószer 5%-os vizes ecetsav). Aminosav-elemzés (savas hidrolízis tioglikolsav jelenlétében): Glu 0,97, His 0,97, Trp 0,94, Ser 0,88, Tyr 1,0, Leu 1,00, Nie 1,06, Arg 1,03, Pro 1,00, Gly 1,03 (87%-os kihozatal). 3—13. példák Ha a 2. példában ismertetett módon járunk el, de az ott használt kiindulási anyagok helyett az alábbi II. táblázatban felsorolt kiindulási anyagokat használjuk, akkor ugyancsak az alábbi II. táblázatban felsorolt I általános képletű dekapeptidamidokat kapjuk 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
