174039. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz-izomerázt tartalmazó baktériumsejtek kondicionálására
3 174039 4 színtelen lesz és pH-ja 7,5—8,0 értéken (60°C-on mérve) stabilizálódik, vagy pedig a baktériumsejtek ágyán 10°C és 27°C közötti hőmérsékleten és 8,0 pH értéken (25°C-on mérve) addig áramoltatunk át vizet, míg az ágyat elhagyó folyadék színtelen lesz és pH-ja 8,0 értéken (25°C-on mérve) stabilizálódik, és ezután a baktériumsejtek ágyán 58—62 °C-on addig áramoltatunk át vizes glükózoldatot, míg az ágyat elhagyó folyadék glükóztartalma azonos lesz az ágyra felvitt oldat glükóztartalmával, ahol adott esetben kobalt- és magnéziumvegyületet, valamint citromsavat tartalamazó vizet, illetve vizes glükózoldatot használunk. A találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként alkalmazott, glükóz-izomerázt tartalmazó baktériumsejteket önmagában ismert módon állíthatjuk elő. Előnyösen knndulási anyagként olyan sejteket használunk, amelyeket Streptomyces olivaceus NRRL—3583 vagy e törzs valamelyik mutánsa megfelelő tápanyagokat tartalmazó táptalajon végzett merített aerób tenyésztése útján, a 3 625 828 számú USA-leírásban ismertetett módon kaphatunk. A tenyésztés során képződő sejteket a fermentléből szűrés vagy centrifugálás útján különítjük el. A glükóz-izomeráz immobilizálását szintén többféle ismert módszerrel végezhetjük. Egy előnyös módszer abban áll, hogy az elkülönített baktériumsejteket vizes közegben szuszpendáljuk, majd a sejtek szárazsúlyára számítva mintegy 0,1 súly% és mintegy 50 súly% közötti mennyiségű glutáraldehiddel összekeverjük. Tekintettel arra, hogy az enzimet tartalmazó baktériumsejteket rendszerint különböző helyeken és az izomerizáláshoz történő felhasználásukat megelőzően állítjuk elő, a sejteket szárítjuk tárolásra, illetve szállításra alkalmassá tételükre. Bármely hagyományos felépítésű szárítóberendezésben közel 60—70°C-on elvégezhetjük ezt a szárítást mintegy 3—10 súly% nedvességtartalomra. A kapott agglomerálódott száraz sejtek azután megfelelő méretre apríthatok oszlopágyban történő felhasználásukhoz. Az agglomerálódott száraz sejttömeg könnyen kisebb darabokra aprítható anélkül, hogy magukra az egyedi sejtekre ez az aprítás káros lenne. Ezen aprítás során olyan frakciót gyűjtünk, amely fennmarad 60 mesh (azaz 25,4 mm-nyi hosszban 60 lyukat tartalmazó) lyukméretű szitán és átesik 20 mesh (azaz 25,4 mm-nyi hosszban 20 lyukat tartalmazó) lyukméretű szitán. Ha a baktériumsejtek így készített agglomerátumait glükózból kündulva fruktóztartalmú cukorlé előállításához kívánjuk felhasználni, akkor az eddigi gyakorlat szerint a sejteket oszlopban helyezték el és megkezdték a glükózoldat átbocsátását az oszlopon megfelelően megválasztott hőmérsékleti és pH viszonyokat tartva. Általában azonban jelentős időtartamra volt ahhoz szükség, hogy az izomerizációs reakció viszonylag állandó mértékű legyen. Ezidő alatt a képződött izomerizálódott cukorlé színe nem volt megfelelő. Megfigyelték továbbá, hogy a sejtek hasznosíthatósági időtartama előnytelenül rövid volt. A találmány értelmében a baktériumsejteket először vízzel vagy vizes glükózoldattal keverjük össze. Az utóbbi előnyösen keményítő enzimes lebontása útján kapott cukrosított, nagy glükóztartalmú oldat. Ez az oldat célszerűen mintegy 30-50 súly% oldott szilárd anyagot tartalmaz, míg az oldott szilárd anyag célszerűen mintegy 93—96 súly%-a glükóz. Áz oldat glükózekvivalense továbbá mintegy 97—98 értékű. A sejtekhez kevert vizet vagy glükózoldatot a száraz sejtek egy súlyrészére vonatkoztatva mintegy 10 súlyrésznyi mennyiségben használjuk. A sejtekhez kevert víz vagy glükózoldat hőmérsékletét mintegy 10°C és mintegy 27°C közé állítjuk be. Ez a víz vagy glükózoldat továbbá célszerűen mintegy 0,0005 mólos koncentrációban valamilyen kobalt - vegyületet, példáult kobalt-kloridot, továbbá mintegy 0,005-0,007 mólos koncentrációban valamilyen magnéziumvegyületet, például magnézium-hidroxidot és mintegy 0,01 grammegyenértéksúlynyi mennyiségben valamilyen kelátképző és pufferoló hatású vegyületet, például citromsavat tartalmazhat. A citromsav előnyösnek bizonyult, minthogy oldható kelátkomplexet képez kobalt- és magnéziumionokkal, továbbá a kívánt pH-értéken vízben és glükózoldatban egyaránt pufferoló hatású. A víz vagy a glükózoldat pH értéke 25°C-on mérve célszerűen 8,0. Ez a pH-érték könnyen biztosítható megfelelő mennyiségű nátrium-hidroxid adagolása útján. A sejteket és a vizet vagy a glükózoldatot kismértékű keverés meliert mintegy 1 órán át hagyjuk érintkezni abból a célból, hogy a sejtek megfelelően hidratálódjanak és a pH egyensúlya beálljon. A fenti lépésben kapott, sejtekből és vízből vagy glükózoldatból álló szuszpenziót ezután megfelelő köpennyel ellátott oszlopba töltjük úgy, hogy a kialakuló sejtágy mérete (hossza) ülepedés után mintegy 89-100 cm legyen. A szuszpenzió betöltése során a lehetőség szerinti legkevesebb keverést alkalmazunk annak érdekében, hogy elkerüljük a sejtagglomerátumok mechanikai sérülését. A találmány szerinti eljárás egyik foganatosítási módja értelmében ezután a sejtágyon az előző lépésnél említett összetételű, 7,5—8,0 pH értékű (60°C-on mérve) glükózoldatot bocsátunk át 58—62°C-on, előnyösen 60°C-on 53—61 liter/m2 /perc átfolyási sebességgel (az átfolyási sebességnél a „m2 ” az ágy keresztmetszeti területét adja meg). Ennél az átfolyási sebességnél a sejtagglomerátumok ülepedett állapotukban mérhető térfogatukhoz képest mintegy 55-60 térfogat%-kal kitágulnak, továbbá a sejtagglomerátumok kívánatos osztályozódása és átrendeződése következik be. Amikor a glükózoldat átáramoltatását a sejtágyon megkezdjük, akkor az oszlop köpenyén át 60°C-os fűtőfolyadékot áramoltatunk keresztül. Az oszlopot kezdetben elhagyó eluátum jelentős mértékben elszínezett, minthogy a baktériumsejtekből származó különböző maradékokat tartalmazza. A forró glükózoldatot célszerűen addig áramoltatjuk az oszlopon át, míg az oszlopot elhagyó folyadék színtelen lesz és 60°C-on mért pH-ja 7,5-8,0 értéken stabilizálódik. Ez az állapot azután következik be, hogy az oszlopon a sejtágy térfogatának két-háromszorosa áramlik át a glükózoldatból mintegy 1—3 óra alatt. A glükózoldat átáramoltatását 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
