173987. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-(6- acil-oxi-benzotiazol-2-il)- N,-fenil(vagy szubsztituált fenil)- karbamidok előállítására
5 173987 6 portot jelent, a fenil-észter-részt közömbös csoportok, mint 1—3 szénatomszámú alkil- vagy alkoxicsoport, halogénatom, nitro- vagy trifluor-metil-csoport szubsztituálhatják. E vegyületek immunszabályozó tulajdonságúak hasonlóan az eredeti fenil-észter-vegyületekhez és szintén beletartoznak a találmány oltalmi körébe. A szükséges II általános képletű reagensek a következő két szintetikus eljárás valamelyikével állíthatók elő. Mindkét eljárás kiíndulóanyaga a 2-amino-6-hidroxi-benzotiazol, mely kínon és tiokarbamid kondenzálásával [J. Org. Chem. 35, 4103 (1970)] vagy 2-amino-6-metoxi-benzotiazol demetilezésével [J. Hetero. Chem. 10, 769 (1973)] állítható elő. Az első szintézisnél a 2-amino-6-hidroxi-benzotiazol 2-aminocsoportján karbamátcsoportot képezünk fenil-klór-formiáttal, például p-nitro-fenil-klór-formiáttal. Ezután a karbamátot trimetil-szilil-kloriddal reagáltatjuk Greber és Kricheldorf [Angew. Chem. Internat. Edit. 7, 941 (1968)] módszerével. A trimetil-szilil-csoport kettős funkciót tölt be az eljárásnál. Elsősorban a p-nitro-fenil-karbamát-csoportot izocianátcsoporttá alakítja át. Másodsorban a trimetil-szililcsoport védőcsoportként működik a benzotiazol-rész szabad hidroxicsoportján és így megakadályozza a szabad hidroxilcsoport és az egyidejűleg képződő izocianátcsoport közötti reakciót. Az így kapott 6-trimetil-szilil-oxi-benzotiazolil-2-izocianát anilinnal vagy alkalmas szubsztituált anilinnal könnyen reagálva karbamidot képez. A reakcióelegyhez vizet adva a trimetil-szilil-védőcsoport hidrolizál és termékként II általános képletű kiindulóanyagot kapunk. A II általános képletű vegyület előállítására szolgáló másik szintetikus eljárás során a 2-amino-6-hidroxi-benzotiazolt sztöchiometrikus fölöslegű (2 mólig) fenil-izocianáttal reagáltatjuk. Az izocianát túlnyomórészt és elsősorban a karbamátcsoporttal reagál és így karbamid képződik. Mégis a 6-karbamoil-oxi-származék létrehozásáért „vetélkedő” reakció is mérhető sebességgel megy végbe. Minél nagyobb fölöslegben alkalmazzuk az izocianátot, annál nagyobb a karbamid kitermelése, de a keletkező 6-karbamoil-oxi-származék mennyisége is. A 6-karbamoil-oxi-származék lúgos hidrolízis segítségével könnyen átalakítható a kívánt 6-hidroxiszármazékká. Az I általános képletű vegyületek emlősöknél az immunreakció módosítására használhatók. így e vegyületek az „immunregulátor anyagok” osztályába sorolhatók, amelyek csökkenteni képesek a testidegen fehérjék hatására létrejövő antitestek képződését. Ez a hatás ezért allergiaellenes hatásként is jellemezhető, mivel az allergiás reakció a szervezet idegen fehérjékkel szembeni védekező mechanizmusának (az immunmechanizmusnak) része. (Ez a hatás teljesen különbözik az antihisztamin-hatástól, amely csak az antitest-antigén reakció által felszabaduló hisztaminra hat.) Bár az immunszabályozó aktivitást egerekben, antigénként birka-vörösvérsejteket használva határoztuk meg, nyilvánvaló, hogy ugyanilyen jellegű hatás lenne kimutatható bármilyen idegen fehérjével (antigénnel) szemben bármilyen emlős fajban. Az I általános képletű vegyületeknek a gazdaállatok immunmechanizmusát módosító képességét aktivitásuk alapján, a következő próba szerint határozzuk meg. 20 g-os hím, nem-beltenyésztett Swiss-egerek 5-ös csoportjainak intravénás injekció formájában 5 x 107 birka-vörösvérsejtet adunk be. E sejteket bárányvérből preparáljuk (Alsever-oldatban összegyűjtve) úgy, hogy a sejteket háromszor 0,85%-os konyhasóoldattal kimossuk és 0.85%-os sóoldatban reszuszpendáljuk. A vegyületek 10 napi dózisát — 0,125% methocelt és 0.2% emulphort tartalmazó sóoldatban szuszpendálva - orálisan adagoljuk 0,1 ml dózisokban és a kezelést a birka-vórösvérsejt injekció beadása előtt 3 nappal kezdjük el. Mindegyik vizsgált vegyületet több dózisszinten vizsgáljuk olyan módon, hogy minden következő vegyület-koncentráció az előző koncentrációnak a kétszerese. Kontroll egércsoportot is beállítunk, amelynek vörösvérsejt-injekciót és 10 napi dózisban hatóanyagot nem tartalmazó hípítóanyagot adunk. Az antigén befecskendezése után 6 nap múlva az egereket szívszúrás útján elvéreztetjük és az 5-os egércsoportokból nyert szérumokat összegyűjtjük. Komplement-inaktiválás után standard módszerekkel meghatározzuk a szérumok hemagglutinin-tartalmát úgy, hogy a vizsgált szérumokból sóoldattal felező hígítási sort készítünk és vájt lemezekben 0. 5.-os birka-vörösvérsejt szuszpenziót adunk hozzájuk. A lemezeket 3 óráig 37°C-on inkubáljuk. majd a hemagglutinációs mintákat kiértékeljük. 4x-es (75%-os) vagy ennél nagyobb antitest-redukciót tekintünk szignifikánsnak (a teszt-szérumot a kontroll szérummal összehasonlítva). Az eredményeket 75%-os vagy ennél nagyobb antitest-csökkenést okozó legalacsonyabb hatóanyag-dózis (végpont-dózis) formájában fejezzük ki. A vegyületeket ezen felül az alábbi módosított szérumpróbával is vizsgáljuk. Ezekben a próbákban a fent leírt eljárást úgy módosítjuk, hogy 5-ös csoportok helyett 10-es egércsoportokat használunk. Az egereket a fentiek szerint elvéreztetjük, de az egyes csoportok szérumát nem egyesítjük, hanem egyénileg vizsgáljuk. Az átlagos hemagglutinin-értékeket (log 2 ± standard hiba) mindegyik 10-es csoportra kiszámítjuk és meghatározzuk a p értékeket (Student-féle T-teszttel), összehasonlítva a kontroll csoporttal. Az antitest-titert szignifikánsan csökkentő (p<0,01) legalacsonyabb hatóanyag-dózis határozza meg a végpontot. A hatóanyagot 10 napi dózisban alkalmazzuk, ilyen körülmények közöttt az egereket az antigén-beadást követően inkább a hetedik, mint a hatodik napon véreztetjük el. A jellemző I általános képletű vegyietekkel végzett szerológiai próbák eredményeit az 1. táblázatban foglaljuk össze. Az I. táblázat 1. oszlopa az I általános képletű vegyületek változó R’ szubsztituensét tartalmazza (az R szubsztituens hidrogénatomot jelent). A 2. oszlop az immunszuppresszív végpontot adja meg mint az antitest-titert szignifikánsan csökkentő legkisebb hatóanyag-dózist (mg per kg). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
