173920. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hemagglutinin és neuraminidáz keverék szelektív elkülönítésére influenzavírusból
7 173920 8 értékeket általában 260 nm-nél vagy 280 nm-nél az 5 ultraibolya fotométeren mértük (7 írószerkezet). A kapott 6 frakciókban a nádcukortartalmat Abbé-féle refraktométeren mértük, majd a felülúszó részben a biológiai aktivitást meghatároztuk. A hemagglutinint és a neuraminidázt így kvantitatívan szolubilizáljuk, és a gradiens felső részén a lényegesen gyorsabb ülepedő vírusrészecske maradéktól jól elválasztva találhatók. A hemagglutinin és a neuraminidáz, azaz a keverék kitermelése 90% felett van. 2. példa A vírus szaporítását, koncentrálását és hasítását az 1. példában leírt módon végezzük. A feldolgozást egyensúlyi centrifugálással előre kialakított nádcukor-gradiens felhasználásával végeztük. Az egyensúly beállítása után a gradienst frakcionáltuk és kiértékeltük. A hemagglutinin és a neuraminidáz a gradiens könnyebb részében található a sűrű vírusrészecske maradékoktól jól elválasztva. 3. példa Az 1. vagy 2. példában leírt módon járunk el, de az MRC—2 (A2/Anglia 42/72 típus rekombinánsa) vagy az MRC-11 (A/Port Chalmers/73 típus rekombinánsa) influenza-törzseket használjuk. 4. példa Az 1. és 3. példában leírt módon járunk el, de a reakciókeveréket mokekulaszita-kromatografálással dolgozzuk fel. 5. példa Az A/Pasteur/30C („Mutagrip”, Pasteur-intézet) influenza-vírushoz, amelyet előzőleg formaldehiddel inakvitáltunk, 0,5%-os vizes cetilpiridiniumbromid-oldatot adunk. A detergenst 0,02—0,1% végkoncentrációig adjuk. A feldolgozást az 1., 2. vagy 4. példában leírt módon végezzük. 6. példa Az 1., 2., 4. vagy 5. példában leírt módon járunk el, de a B/Mass/67 influenza-törzset használjuk. 7. példa Az 1., 3., 5. vagy 6. példában leírt módon járunk el, de a felhasított keveréket ultracentrifugában való pelletálással dolgozzuk fel. Ezt például Beckmann L-2—65 B centrifugával (rotor 60 Ti, 35 000 fordulat/perc, 90 perc) végezhetjük. A szolubilizált immunogént a felső frakcióból kapjuk. 8. példa Az 1-7. példákban leírtak szerint járunk el, de cetiltrimetilammóniumbromid-oldat helyett 1%-os mirisztiltrimetilammóniumbromid, benzetóniumklorid, metilbenzetóniumklorid, dekametóniumklorid vagy sztearildimetilbenzilammóniumbromid oldatot használunk, összehasonlítható eredményeket kapunk. 9. példa Influenza-vakcinát a következő módon állíthatunk elő: összetétel Mennyiség immunogén keverék 700 nemzetközi egység tiomerozál 1 sr. 10 000 sr-re foszfátpuffer 0,9%-os fiziológiás nátriumklorid-oldatban 0,5 ml-ig. Az immunogén keveréket az előző példák bármelyikével előállíthatjuk, például a 3. példában leírt módon az MRC-11 influenza-törzs (A/Port Chalmers/73 típus rekombinánsa) felhasználásával. A hemagglutinin és neuraminidáz kitermelésének meghatározásához 50 ml A/Port Chalmers/73 (MRC-11 rekombináns) influenzavírust (0,6 mg protein/ml foszfáttal pufferolt nátriumklorid-oldat) 30 percig szobahőmérsékleten [14C]-cetil-trimetilammóniumbromiddal (0,03% végkoncentráció) inkubáltunk. Az elválasztást Beckmann Ti 15 típusú zónás centrifugával végeztük, a lineáris nádcukor-gradiens 5 és 50% között volt foszfáttal pufferolt nátriumklorid oldatban. A [14C]-izotóp a detergens és a vírus-komponensek kapcsolódásának jelzésére szolgált. A hemagglutinin és neuraminidáz mennyiségét a biológiai aktivitás alapján határoztuk meg. A hemagglutinin tartalom meghatározását végpont-módszerrel 0,5% csirke vörösvérsejt hozzáadásával végeztük [J. of Immun. 96, 956 (1966)]. A neuraminidáz tartalom megállapítása az N-acetil-neuraminsav meghatározásával történt [Biochem. J. 81, 384-392 (1961)]. A szolubilizált hemagglutinint és neuraminidázt tartalmazó frakciókban a detergens mennyiségét dialízissel 1% alá csökkentettük. A hemagglutinin és neuraminidáz keverék aktivitását centrifugálás után a szolubilizált és a vírusburkot tartalmazó frakciókban a következő táblázat szemlélteti. Az összehasonlítás a teljes vírussal történt. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
