173920. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hemagglutinin és neuraminidáz keverék szelektív elkülönítésére influenzavírusból
3 173920 4 immunizáló hatást mutattak [B. A. Rubin és munkatársai, Archiv für Virusforschung 20, 268 (1967), R. G. Webster és munkatársai, J. of Immunology 96, 596 (1966)]. A találmány tárgya eljárás a hemagglutinin és neuraminidáz immunogén keverék elkülönítésére ezen komponensek szelektív szolubilizálásával, miközben a fennmaradó szubvirális részecskék, amelyek ép lipid/proteinmembránból állnak, és a vírus összes egyéb, nem lényeges részét tartalmazzák, visszamaradnak. A szolubilizált immunogén keverék és a visszamaradó szubvirális részecskék mérete és sűrűsége közötti különbség lehetővé teszi az immunogéneknek a szokásos elválasztási módszerekkel való szétválasztását, amelyek a fizikai tulajdonságok közötti különbségen alapulnak. Azt találtuk, hogy a hemagglutinin és neuraminidáz keverék fenti szelektív szolubilizálását az influenza-vírus kationos detergenssel történő kezelésével érhetjük el. A találmány tárgya tehát eljárás a hemagglutinin és neuraminidáz immunogén keveréknek A és B típusú influenza-vírusból való elkülönítésére az influenza-virusnak vizes közegben kationos detergenssel történő kezelésével az immunogén keverék szelektív szolubilizálására és az így kapott szolubilizált immunogén keveréknek a visszamaradó szubvirális részecskékből történő elválasztására. A találmány szerint kationos detergensek felhasználásával az immunogén keverék szelektíven szolubilizálható, így az immunogén keverék lényegesen egyszerűbben elkülöníthető és tisztítható, mint az eddig ismert módszerek esetében [például J. Exp. Med. 112,765 (I960)], amelyeknél az influenza-vírus kezelése a teljes vírus megbomlását eredményezte, és a nem lényeges komponensek is felszabadultak. A találmány szerinti eljárást az A, Al, A2 vagy B influenza-vírusok vagy az említett vírusok közül kettő vagy több keverékének felhasználásával végezhetjük. A specifikusan alkalmazott törzs természetesen a kívánt immunitástól és az izolálandó immunogénektől függ, de megemlíthetjük például a következő törzseket: A2/Aichi/68, MRC-2 (az A2/Anglia 42/72 típus rekombinánsa), MRC-11 (az A/Port Chalmers/73 típus rekombinánsa), A/Pasteur/30C („Mutagrip”, Pasteur-intézet) és B/Mass/67 törzsek. A találmány szerinti eljárásban felhasznált influenza-vírus törzset célszerűen ismert módon szaporítjuk, például 11 napos embriót tartalmazó tyúktojásba való átoltással és megfelelő ideig megfelelő hőmérsékleten, például 2 napig 37 °C-on való inkubálással. Ezután a kapott allantois-folyadékot egyesítjük, és a vírust ultracentrifugálással és ezt követően például foszfáttal pufferolt, fiziológiás nátriumklorid-oldatba való reszuszpendálással vagy átfolyó zónás centrifugával például foszfáttal pufferolt fiziológiás nátriumklorid-oldatban nádcukor-gradienssel a nádcukortartalom például 5% alá való csökkentésével, célszerűen fiziológiás nátriumklorid-oldattal szemben történő dialízissel vagy Sephadex-kromatográfiával vagy hígítással besűrítjük és tisztítjuk. A kiindulási vírus koncentrációja nem kritikus és az immunogén keverék kívánt mennyiségétől (tartalmától) függően beállítható. A vírussűrítmény pH-értéke célszerűen 6,5—8,5 lehet, amelynek beállításához puffert, például foszfátpuffert használhatunk, és ezt a kationos detergens hozzáadása előtt alkalmazzuk, és a sűrítményt például formaldehid hozzáadásával inaktiválhatjuk. Ezután a víruskoncentrátumhoz a kationos detergenst célszerűen vizes oldat alakjában adjuk. A kationos detergens mennyisége, amelyet hozzáadunk, például az alkalmazott detergenstől függ. Általában az alkalmazott kationos detergenst olyan mennyiségben adjuk, hogy a kapott keverékben a detergens és a protein súlyaránya 1 :2-1 :10, elsősorban 1 :3-1 : 5 legyen. A detergens hozzáadása után a keveréket célszerűen állni hagyjuk, például 30 perctől 16 óráig terjedő ideig, például 4—37 °C-on. Magasabb hőmérséklet kevesebb időt igényel. Á keveréket előnyösen 30-60 percig szobahőmérsékleten vagy éjszakán át 4 °C-on tartjuk. A találmány szerint alkalmazható kationos detergens minden olyan kationos detergens lehet, amely a hemagglutinin- és neuraminidáz-komponensek keverékének szolubilizálásához kielégítő aktivitású, de a reakciókörülmények között nem annyira aktív, hogy az egész vírus részecskét megbontsa. A találmány szerinti eljárásban felhasználható kationos detergenseket az ismert I általános képletű vegyületek csoportjából választhatjuk ki. Ebben a képletben R4 alkil- vagy arilcsoportot, Rí, R2 és R3 egymástól függetlenül alkil- vagy arilcsoportot jelentenek, vagy Rí és R2 a hozzájuk kapcsolódó nitrogénatommal együtt 5- vagy 6-tagú telített heterociklusos gyűrűt alkotnak, és R3 alkilvagy arilcsoportot jelent vagy Rt, R2 és R3 a hozzájuk kapcsolódó nitrogénatommal együtt 5- vagy 6-tagú, a nitrogénatomon telítetlen heterociklusos gyűrűt alkotnak, és X egy aniont jelent. [Ullmanns Encyclopädie der technischen Chemie, 9. kötet 302-304 (1957)]. Az I általános képletű vegyületek közül előnyösek az la általános képletű vegyületek - ebben a képletben X a fenti jelentésű, és R4’ 8-22 szénatomos alkilcsoportot jelent, és Rf és R2’ egymástól függetlenül metilcsoportot vagy 8—22 szénatomos alkilcsoportot jelentenek vagy Rt ’ metilcsoportot és R2 ’ benzilcsoportot jelent —, különösen az laa általános képletű vegyületek — ebben a képletben R4’ és X a fenti jelentésűek - vagy láb általános képletű vegyületek- ebben a képletben R4’ és X a fenti jelentésűek -. További előnyös I általános képletű vegyületek az 1b általános képletű vegyületek — ebben a képletben X a fenti jelentésű, és R4” 12-18 szénatomos alkilcsoportot és Rs hidrogénatomot vagy metilcsoportot, előnyösen hidrogénatomot jelent —. A 8-22 szénatomos alkilcsoportok közül előnyösek a 12—18 szénatomot tartalmazók. Előnyös 12-18 szénatomos alkilcsoport elsősorban a laurü-, mirisztil-, cetil- és sztearil-csoport. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
