173676. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükopeptidek előállítására
9 173675 10 15 percig 68°C-on keverjük, majd jégfürdőn hűtjük, és 30 percig 4°Con, 8000 g gyorsuláson centrifugáljuk. A centrifugacsőben négy elkülönült fázis, azaz egy szilárd alsó fázis, egy fenolos fázis, egy fehér közbülső fázis, s egy felső vizes fázis jelenik meg. A vizes fázist elöntjük, a többi fázist pedig 350 ml 68°C-os desztillált vízben szuszpendáljuk, és a szuszpenziót a fent ismertetett körülmények között újra extraháljuk. A centrifugálás után kapott felső vizes fázist ismét elöntjük, a fennmaradó fázisokat egyesítjük, és a fenol eltávolítása céljából 4 naj>ig folyó csapvízzel szemben, majd 3 napig 4 C-os desztillált vízzel szemben dializáljuk. 1 hét elteltével a dializáló edényben háromfázisú üledék jelenik meg. Az alsó, sötét színű fázis DNA-val kötött sejttörmelékből áll, e fölött helyezkedik el az olajos konzisztenciájú, barnás-krémszínű második fázis. E kát fázis immunreakciót fokozó hatása csekély, vagy ilyen hatással egyáltalán nem rendelkeznek. A felső, fehér fázist elválasztjuk, majd a vizet eltávolítjuk. így a glükopeptidet kapjuk, amelyet a továbbiakban ,A” glükopeptidnek nevezünk. Az „A” glükopeptid fizikai sajátságai: a) Dimetilszulfoxidban gyengén oldódik, vízben, fenolban, etanolban, metanolban, kloroformban, dioxánban, piridinben, dimetilformanádban, dietilénglikolban, hexánban, acetonban, étedben és fiziológiás sóoldatban oldhatatlan. b) A termék lényegében lipidmentes [J. Falch és munkatársai: J. Biol. Chem. 226, 497 (1957)]. c) Fenol-víz keverékben szuszpendálva az átmeneti fázisban dúsul fel. d) A termék mikroanalízissel meghatározott demi összetétele a következő: szén: 39,03 súly%, hidrogén: 6,24 súly%, nitrogén: 9,03 súly%, foszfor: nyomokban, hamu: 5,4 súlv%, szilícium: 1,48 súly%, kén: <0,2 súly%, oxigén (a különbség alapján számítva): körülbelül 40 súly%. A szén-, hidrogén- és nitrogén-tartalmat Perkin-Elmer 240 típusú félautomatikus elemzőberendezéssel határoztuk meg. e) 1,5 mg szilárd anyag szabványos, 16 mm átmérőjű káliumklorid-pasztillában felvett infravörös spektrumában a következő sávok jelennek meg (itt az 1 mg szilárd glükopeptidre vonatkoztatott dnyelést is közöljük, az infravörös spektrum adatait a későbbiekben részletesebben is ismertetjük): Kötés Hullámszám cm"1 Elnyelés/mg CO-NH 1660 0,78 C-OH 1050-1070 0,29» C-H 2850-2950 0,004» » = albuminra vonatkoztatva f) A hidrolizált glükopeptid kromatográfiás elemzése során az alábbi ami no sa va kát és cukrokat mutattuk ki: Aminosavak: ornitin, alanin, valin, leucin és aszparaginsav. (A glükopeptidet zárt ampullában 6 n sósavoldat jelenlétében 18 órán át 100°C-on hidrolizáljuk. A maradékot vízben oldjuk, és Whatman 3 mm papíron kromatografáljuk. 60 ml butanolt, 15 ml ecetsavat és 25-ml vizet tartalmazó oldószer-rendszerrel 18—24 órán át felszálló kromatografálást végzünk. Az aminosavakat ninhidrinnel mutatjuk ki.) Cukrok: galaktóz, glükóz, mannóz és nyomnyi mennyiségű arabinóz. (A glükopeptidet zárt ampullában, 2 n sósavoldat jelenlétében 3 órán át 100°C-on hidrolizáljuk, majd a maradékot piridinben oldjuk, és Whatman 3 mm papíron kromatografáljuk. 60 ml butanolt, 40 ml piridint és 30 ml vizet tartalmazó oldószer-rendszerrel 18-24 órán át leszálló kromatografálást végzünk. A cukrokat anilin-oxalát reakcióval [P. Novotny: J. Med. Microbiol. 2, 81 (1969)] mutatjuk ki. g) A glükopepciden fehérje kimutatására alkalmas biuret-reakciót végzünk (Data for Biochemical Research, Ed. Dawson, R.M.C., Daphne C. Elliott, W.H. Elliott és K.M. Jones, 2. kiadás, O.U.P., Oxford, 1S69, 618. oldal). A glükopeptid kékre színeződik, és a szín nem mosható ki. h) A glükopeptid antron-reakcióban [Spiro,R.C.: Methods in Enzymology 8, 3 (1966), Ed. Neufeld, E.F. és Ginsberg, V., pub. Academic Press, New York és London) pozitív eredményt ad, a reakcióelegy kékeszöldre színeződik. 2. és 3. példa Immunreakciót fokozó hatású glükopeptid elkülönítése C. par'/um sejtekből Az 1. példában leírt eljárással, az ott ismerteteti C. parvum törzset felhasználva két további glükopeptid-készítményt állítunk elő, amelyeket a továbbiakban „B”, illetve „C” glükopeptidnek nevezünk. 4. példa Immunreakciói fokozó hatású glükopeptid elkülönítése C. parvum sejtekből Az 1. példában leírt eljárás ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a lizátum, a víz és a fenol elegyét a 8000 g gyorsuláson 30 percig végzett centrifugálás helyett 1500 g gyorsuláson 1 órán át centrifugáljuk. Az így kapott glükopeptidet a továbbiakban „D” glükopeptidnek nevezzük. 5. példa Az 1. és 2. példa szerint előállított glükopeptidek fizikai sajátságai (1) Az „A” és ,3” glükopeptid 16 mm átmérőjű szabványos káliumhaogenid-pasztillában 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
