173662. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ovulációt serkentő új nonapeptidamid-származékok előállítására
11 173662 12 nyomáson szárazra pároljuk és vízzel alaposan mossuk. így 8,3 g terméket kapunk. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során ez a termék egyetlen Pauly- és Ehrlich- pozitív foltot ad, Rfl = 0,29, RfJ=0,68, és Rf3=0,43. Az így kapott termékből 7 2 g-ot feloldunk 50 ml metanolban, majd jeges hűtés közben az oldathoz lassan 30 ml 1 n nátrium-hidroxid-oldatot adunk a hidrolízis végrehajtására. A kapott elegy et szobahőmérsékleten 3 órán át keverjük, majd 30 ml 1 n sósavoldat adagolása után lehűtjük, amikor is csapadék válik ki. Ezt kiszűrjük, hideg vízzel mossuk és szárítjuk. A terméket ezután 5%-os vizes etanolban feloldjuk, majd az így kapott oldatot 3 cm átmérőjű és 25 cm hosszú, Amberlite XAD-2 gyantából készült oszlopra felvisszük. Az eluálást gradiens-módszerrel végezzük, 800 ml 5%-os vizes etanolt és 800 ml 90%-os vizes etanolt használva. A cím szerinti vegyületet tartalmazó frakciókat összeöntjük, csökkentett nyomáson betöményítjük az etanol eltávolítására és liofilizáljuk. így 5,9 g terméket kapunk. Rf^O.Ol, Rf1=0,62, Rf3=0,34. Elemzési eredmények a C34H38NgC)9 • H20 képlet alapján: számított: C = 56,65%, H =5,59%, N = 15,55%, talált: C =56,39%, H=5,70%, N = 15,52%. Aminosav-elemzés (hidrolízis 5,7 n sósavoldattal tioglikolsav jelenlétében): Glu=lj05, His = 0,98, Trp = 0,95, Ser = 0,98, Tyr = 1,03. (b) Z{D)-Ala-Leu-Aig(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 30 ml dioxán és 10 ml dimetil-formamid egyében feloldunk 1,14 g H-Leu-Arg(N02 )-Pro-NH-CH2 - -CH3-t és 447 mg Z-(D)-Ala-OH-t, majd a kapott oldathoz 400 mg HONB-t adunk és az elegyet gyorsan lehűtjük. 460 mg DCC beadagolása után az elegyet 20 órán át keverjük, majd a képződött diciklohexil-karbamid mellékterméket kiszűrjük és a szűrletet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A kapott maradékot melegítés közben etil-acetátban feloldjuk, ezután pedig az oldatot először 4%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd vizzel mossuk és vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, végül pedig csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot melegítés közben ismételten feloldjuk kis mennyiségű etil-acetátban, majd az oldatot szűrjük a kismennyiségű oldhatatlan anyag eltávolítására. A szűrletet állni hagyjuk, amikor is tűkristályok válnak ki. Ezeket a kristályokat kiszűrjük, etil-acetáttal mossuk és szárítjuk. így 1,30 g 183—184 °C olvadáspontú cím szerinti terméket kapunk, amelynek fajlagos forgatóképessége [a]“ =-492° (c = 0,5, metanolban). Elemzési eredmények a C^I^OgN, képlet alapján: számított: C =54,45%, H =7,16%, N = 19,05%, talált: C =54,42%, H=728%, N = 18,86%. Rf*= 0,78, Rf3= 0,90, Rf4=0,65. (c) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CH2 -CH3 előállítása 20 ml ecetsavban feloldunk 155 mg kristályos Z-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3-t, majd a kapott oldathoz 100 mg palládiumkormot adunk. Az elegyen ezután a környezet hőmérsékletén és atmoszférikus nyomáson 5 órán át hidrogéngázt vezetünk keresztül. Ezt követően a katalizátort kiszűrjük, majd 0,45 ml 1 n sósavoldat beadagolása után a szűrletet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 10 ml vízben feloldjuk, majd liofilizáljuk. Az így kapott fehér pelyhes csapadékot és 141 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH-t feloldjuk 10 ml dimetil-formamidban, majd a kapott oldathoz 60 mg HONB-t adunk. Az elegyhez ezután jeges hűtés közben N-etil-morfolin dimetil-formamiddal készült 10%-os oldatából 025 ml-t és 50 mg DCC-t adunk. A reakcióelegyet ezután jeges hűtés közben 5 órán át, majd szobahőmérsékleten 10 órán át keverjük. Ezt követően a dimetil-formamidot csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, majd a maradékhoz 20 ml vizet adunk. A vizes oldatból az oldhatatlan részt kiszűrjük, majd a szűrletet fel visszük egy 1 cm átmérőjű és 5 cm hosszú, Amberlite IRA-410 (acetát formájú) gyantából készült oszlopra. Az oszlopot 50 ml vízzel eluáljuk. Az eluátumot és a mosóoldatokat összeöntjük, majd felvisszük egy 1,5 cm átmérőjű és 25 cm hosszú, karboximetil-cellulózból készült oszlopra. Az eluálást gradiens-módszerrel végezzük, 300 ml 0,005 mólos ammónium-acetát-oldatot és 300 ml 0,175 mólos ammónium-acetát-oldatot használva. A 170 ml és 240 ml közötti frakciókat összeöntjük, majd liofilizáljuk, amikor is 208 mg fehér pelyhes port kapunk. Ennek a terméknek a vékonyrétegkromatográfiás elemzése egyértelműen kimutatja egy nagy Rf-értékű szennyeződés jelenlétét. Ezért a terméket tovább tisztítjuk egy 2 cm átmérőjű és 20 cm hosszú, Amberlite XAD-2 gyantából készült oszlopon vizes oldatát átbocsátva a vizzel előkészített oszlopon és az eluálást gradiens-módszerrel végezzük 250 ml vizet és 280 ml 75%-os vizes etanolt használva. A 170 ml és 250 ml közötti frakciókat összeöntjük, majd az etanol csökkentett nyomáson végzett ledesztillálása után liofilizáljuk. így 129 mg terméket kapunk. Rfl= 0,062, Rf3= 0,358. Fajlagos forgatóképesség [ot]J>6 = -47,0° (c = 0,5, 5%os vizes ecetsavoldatban). Aminosav-elemzés (hidrolízis sósavval tioglikolsav jelenlétében): Glu = 0,98, His = 1J05, Trp = 1,04, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
