173548. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns influenza-vírustörzs és e törzset tartalmazó vakcina előállítására
5 173548 6 emberrel szemben virulenciáját megtartotta, és a törzset előzetesen csak tyúktojáson vagy a szabályozó hatóságok által elfogadott más tenyészeteken, például a National Institute for Biological Standards (Holly Hill, Hampstead) által elfogadott 5 tenyészeteken tenyésztették. Második törzsként előnyösen a közvetlenül rekombináns törzset tartalmazó vakcina előállítása előtt elkülönített törzset alkalmazunk. Ebben az esetben igen nagy mértékben fokozódik annak a valószínűsége, hogy a vak- 10 cina a jövőbeli járványkeltő törzzsel szemben megfelelő mértékű immunitást vált ki, minthogy e két törzs antigén szempontból hasonló egymáshoz. így például bejelentésünk elsőbbségi napján viru- 15 lens törzsként sikeresen alkalmaztuk az A/ENGLAND/42/72 (H3N2) vírust. Ezután különítettük el az A/FINNLAND/4/74 (H3N2) vírust, amelyet igen alkalmasnak találtunk rekombináns influenza-vírus-törzset tartalmazó vakcina kialakí- 20 tására. Mindkét törzset a National Institute for Biological Standards and Control, London intézetben helyeztük letétbe, ahol azok bárki számára beszerezhetők. A találmány tehát egyrészt (a) valamely, kizáró- 25 lag tyúktojás-tenyészetekben gyenge fertőzőhatásig továbbtenyésztett, e tenyészeten jó szaporodóképességű, EIDSo/ml értéke >10®, és borjú-vesesejteken foltot képező túlgyengített A-típusú influenza-vírustörzsből és (b) valamely, tenyésztéskor 30 az előbbinél kevesebb vírust szolgáltató, de borjú-vesesejteken több foltot képező és szennyező emlős-vírusoktól mentes virulens A-típusú influenza - -vírustörzsből kialakított rekombináns influenza-vírustörzsek előállítási eljárására vonatkozik. 35 A virulens és a legyengített törzs rekombinálása előtt egyes esetekben az alaptörzseket célszerűen klónozásnak vetjük alá. A klónozás olyan módszer, amellyel olyan kiónt vagy vírustenyészetet lehet 40 kapni, amelyben minden vírus egyetlen vírusrészecskéből származik úgy, hogy valamennyi utód genetikai állománya azonos. A klónozás egyik módja szerint fertőzött tenyészléből hígítási sort készítünk, azt tojásokba fecskendezzük és a leg- 45 nagyobb hígítással fertőzött tenyészeteket tovább tenyésztjük, lásd Textbook of Virology, A. J. Rhodes, C. E, van Rooyan, 3rd ed., 1958, Williams and Wilkins Co. Továbbá, a letétbe helyezett törzsek rendszerint liofilizált állapotban állnak 50 rendelkezésre, így a rekombináns törzs kialakításának előzetes műveletként ezeket a törzseket megfelelő közegben, például foszfáttal pufférólt nátriumklorid-oldatban és triptóz-foszfát-táptalajban rekonstituáljuk. A közeghez célszerűen antíbiotiku- 55 mot adunk, ami elöli az adott esetben jelenlevő baktériumokat. A mikroorganizmust tojások, célszerűen specifikus patogénmentes (SPF) tojások allantoisz-üregébe oltjuk be, majd inkubálás után az allantoisz-folyadékot elkülönítjük, és felhaszná- 60 lásig alacsony hőmérsékleten tároljuk. A két törzs megfelelő rekombinálódásának biztosítása céljából arra van szükség, hogy a törzsek tyúktojásokon észlelt vírusképző kapacitása ne tér- 65 jen el túl nagy mértékben egymástól. Ennek érdekében a nagy vírusképző kapacitással rendelkező legyengített törzset előzetesen ultraibolya fénnyel vagy gamma-sugarakkal besugározzuk vagy hőkezelésnek vetjük alá úgy, hogy. az eredeti fertőzőképességet lényegesen csökkentsük, azaz a vírus teljes fertőzőképességét körülbelül 99%-ban inaktiváljuk és így a törzs sza porod óképességét a viszonylag kis szaporodóképességű virulens törzsével azonos szintre hozzuk. Ezt a műveletet és a következő rekombinációs lépéseket, amelyek során a vírustörzsek mintáit egyetlen tojás-tenyészeten együtt hagyjuk növekedni, a Postgraduate Medical Journal 49, 195—199 (1973) szakcikk ismerteti. Rá kell mutatnunk arra, hogy ha ugyanazokat a vírustörzseket ugyanolyan típusú sejteken azonos körülmények között rekombináltatjuk is, a törzsek rekombinációja egyes esetekben tenyészetről tenyészetre nem reprodukálható tökéletesen, azaz a kapott rekombináns vírustörzsek egyes sajátságai például azok szaporodóképessége - tenyészetről tenyészetre kis mértékben eltérhetnek egymástól. A lehetséges rekombinációk száma azonban igen korlátozott, és ésszerű próbákkal vagy kísérletekkel olyan vírustörzset alakíthatunk ki, amely minden tekintetben megfelel a találmány szerinti követelményeknek. Ha legyengített vírus-alaptörzsként az előnyösnek talált A(OKUDA)57 törzset használjuk fel, tapasztalataink szerint csaknem az összes lehetséges rekombináns alkalmas vakcina előállítására. A rekombináns vírustörzseket a találmány szerint előnyösen úgy állítjuk elő, hogy a legyengített alaptörzset ultraibolya fénnyel besugározzuk, majd a legyengített alaptörzset és a virulens alaptörzset 10 napos SPF tojásokból származó, héjon nevelt allantoisz-tenyészetekbe (AOS-tenyészet) oltjuk be, [S. Fazekas de St. Groth, P. 0. White J. Hyg. 57, 151 (1958)] és a rendszert inkubáljuk. Inkubálás után minden tenyészethez antigén szempontból a legyengített alaptörzsével azonos vagy ahhoz hasonló hemagglutinint tartalmazó, nagymértékben tisztított vírussal szemben előállított hiperimmun szérumot, előnyösen nyúl- vagy menyét-szérumot adunk. Ilyen hiperimmun szérumot úgy készíthetünk, hogy egy felnőtt nyulat 14 naponként, kétszer vagy háromszor, 106 hemagglutinációs egyket tartalmazó, 1 ml-ben oldott tisztított teljes vírussal (k.b 20 mg fehérje/ml) beoltunk. Az így termelt hiperimmun szérumot az utolsó injekció után három héttel összegyűjtjük. Hiperimmun szérumot használva, a legyengített alaptörzs szaporodása oly mértékben csökkenthető, hogy a rekombináció után kapott vírustörzs már csak igen kisszámban tartalmaz alaptörzsbeli vírust. Minthogy a túlgyengített alaptörzshöz viszonyítva a virulens alaptörzs szaporodóképessége viszonylag csekély, e vírus szaporodóképességét nem szükséges a fentihez hasonló módon visszaszorítanunk. A további beoltás után hemagglutinációt mutató tenyészeteket összegyűjtjük, a tenyészetek mintáit hemagglutinációs [1. Medical Microbiology, Ed. R. Cruickshank, 11 th Edition, (1968) Livingstone Ltd. 945. oldal] és neuraminidáz-gátló kísérletek3
