173535. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(alfa-amino-adipoil)-amino-3-metil-3-cefém-4-karbonsav fermentációs úton történő előállítására
17 173535 18 A frakcionálási előnyösen végezhetjük ioncserélő gyantákon, aktívszénen, cellulózon, szilikagélen és hasonlókon végrehajtott kromatografálással és gélfiltrálásos módszerrel megfelelő kombinációban. A DACPC mennyiségi meghatározására alkalmas az a 5 módszer, amelynek .során a termék valamely kísérleti organizmus elleni antibiotikus potenciálját állapítjuk meg. A termék azonosítására előnyösen használhatók az elemanalízis, az NMR spektrometria (nuclear magnetic resonance spectromstry), 10 infravörös spektrometria, ultraibolya spektrometria, pepír-elektroforézis és a vékonyr éteg-kromatográfia, ás hasonló módszerek. Amennyiben ezeket a módszereket egymással kombináljuk, a DACPC-t szabad vegyidéiként vagy sóként különíthetjük el. A találmány szerinti eljárást az alábbiakban részletesebben ismertetjük. A táptalajok készítéséhez használt egyes alkotórészek a következő cégek gyártmányai: 20 Polipepton: Daigo Eijo Co., Japán Szójabab-liszt: Honen Seiyu Co., Japán Gyapotmag-liszt: Proflo, Traders Oil Mill Co., USA Szárított élesztő: sör élesztő 25 Kukoricalekvár: Corn Product Co., USA Kukoncakeményítc: Sanwa Denpun Co., Japán Nyers szójabab-liszt: Yoshihara Seiyu Co., Japán Földimogyoró-lepény: Meito Oil Mill Co., Japán. 30 A DACPC meghatározása a következőképpen történik: A szűrt fermentlevet cellulóz-lemezen, n-butanol-ecetsav-viz 3:1:1 rendszerrel vékonyr ét eg kro ma- 35 tográfiának, vagy 10%-os ecetsavval 47,5 V/cm áramsűrűség mellett 100 percen át papírelektroforézisnek vetjük alá, a DACPC-nek megfelelő foltot vízzel eluáljuk, majd biológiai értékméréssel, Pseudomonas aeruginosa PsCssO) lemezen, vagy 40 Aerobacter cloacae IFO 12937 3 mutánsból21 nyert részlegesen tisztított cefalosporinázt használva vizsgáljuk. [CD: Y. Fujisawa, H.Shirafuji, M.Kida. K. Nara, M.Yoneda, T.Kanzaki: Nature, New. Bioi. 246, 154 (1973)] 45 [(2>: K. Kitano, K. Kintaka, S. Suzuki, K. Katamoto, K. Nara, Y.Nakao: Agr. Biol. Chem. 38, 1761 (1974)]. 50 Az előállított kristályos DACPC fizikai és kémiai tulajdonságai a következők: IR-spektrum (KBr): jellemző sáv 1750 cm' hullámszámnál (0-laktám), UV-spektrum: H*0 nm (E]^m): 260 (189). [aß4: +144,1“ (c = 0,53, víz). NMR-spektrum: (ppm): 1,65—2,15 (4H, CH2CH2), 2,00 (3H, s CH3), 2,49 (2H, t, J = 7 Hz, CH2CO), 3,30 és 3,70 (2H, ABq, J = l8Hz, 2—CH2), 3,81 (1H, t, J = 5,4 Hz, NH2CHCOOH), 5,14 (1H, d, J = 4,5 Hz, 6-H), 5,63 (1H, A J = 4,5 Hz, 7—H). Elemanalízis a C^H^OéNíSNa • H20 súly: 397,382) összegképletre: 55 m, d, (mólszámított: C - 42,32%, N = 10,57%, Na= 5,79%, mért: C = 42,03%, N = 10,28%, Na= 5,55%. H =5,07%, S =8,07%, H =5,15%, S =8,01%, Az a-amino-adipinsav sztereokonfigurációja: D-forma. A találmány közelebbi bemutatására a következő példákat adjuk meg. Ezekben a példákban a részek súlyrészeket jelentenek, amennyiben másként nem jelöljük, a részek és a térfogatrészek közötti arány pedig megfelel a gramm és a milliliter között’ viszonynak. 1. példa Egy 2000 ml-es Erlenmeyer-lombikba beviszünk 500 térfogatrész olyan inokulum-táptalajt, amely 2% glükózt, 1% maltózt, 1% glicerint, 2% gyapot maglisztet, 1% kukoricalekvárt, 0,3% ammónium-szulfátot, 0,3% ammónium-nitrátot, 0,01% kálium dihidrogén-foszfátot, 0,05% magnézium-szulfát heptahidrátor, 0,005% vas(II)-szulfát heptahidrátot, 0,01% nátrium-kloridot, 0,5% DL-metionint és 1% kálcium-karbonátot tartalmaz. Sterilizálás után a táptalajt beoltjuk egy Streptomyces griseus U-25 (IFO-13550) kultúrából származó spóra-tömeggel és egy sík rázógépen 23 cC-on 72 óra hosszat inkubáljuk. Egy 50 literes fermentorba beviszünk 30 liter olyan vizes táptalajt, amely 3% glükózt, 3% kukoricakeményítőt, 2% gyapotmaglisztet, 1% kukoricalekvárt, 0,3% diammónium-szullatoí, 0,3% ammónium-nitrátot, 0,01% kálium-dihidrogén■foszfátot, 0,05% magnézium-szulfát heptahidrátot, 0,005% vas(II)-szulfát heptahidrátot, 0,01% nátrium-kloridot, 0,5% DL-metionint és 1% kálcium•karbonátot tartalmaz. A kádat a szokásos módon sterilizáljuk és lehűlni liagyjuk. Ezt a táptalajt sterilen beoltjuk a fenti inokulummal és 28 °Con inkubáljuk levegőztetés és keverés közben. A táptalajt 164 órás fermentálás után szűréssel elkülönítjük, amikor is 25 liter szűrletet kapunk. (Ez a szűr let 110 Mg/ml DACPC-t tartalmaz). A kapott szűrlet pH-ját hidrogénkloriddal 5-ös értékre állítjuk be és 8 literes, aktívszénnel töltött oszlopon adszorbeáltatjuk. Vízzel való mosás után az eluálást 20 liter 50%-os vizes acetonnal végezzük. Az eluátumot közvetlenül egy olyan kolonnába visszük, amely 3 liter Amberlite IRA-900 ioncserélő gyantával (acetát-forma, Rohm and Haas Company terméke) van töltve és - vízzel való mosás után - az eluálást 10 liter 0,3 n ammóniumacetáttal végezzük. A keletkező eluátumot másodszor egy 1,5 liter aktívszenet tartalmazó oszlopra visszük és vízzel való mosás után az eluálást 3 liter 50%-os vizes acetonnal végezzük. A keletkező eluátumot csökkentett nyomáson betöményítjük és így 50 ml koncentrátumot kapunk. Az így kapott koncentrátumot 150 ml aktívszénnel töltött oszlopra visszük és vízzel való 9
