173445. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új antibiotikum elegy előállítására
9 173445 10 szélesek és töretlenek. Az aszkospóra a hosszú felezővonalhoz viszonyítva lencse alakú. Ha a kiemelkedés perifériális, az aszkospóra gömb alakú. A gömb alakú aszkospóra átmérője 4,9-6,3 ß, átlagosan 5,4p. Az Aspergillus rugulosus A-30912 antibiotikumot termelő törzsének két jellemzője különbözik a fentiekben említett, Raper és Fennel által leírt A rugulosus jellemzőitől. Az A—30912 antibiotikumot termelő törzs konídium fejei és aszkospórái nagyobbak. Az A—30912 antibiotikum elegy termelésére használható Aspergillus rugulosus kultúrát a Northern Regional Research Laboratory-ban, U.S. Department of Agriculture Research Service, Peoria, Illinois 61604 helyeztük letétbe NRRL8113 szám alatt, itt a köz számára hozzáférhető. Az Aspergillus rugulosus NRRL8113 törzset bármilyen táptalajon tenyészthetjük. Optimális kitermelést és könnyű elválasztást azonban előnyösen bizonyos táptalajon érhetünk el. így például a nagyüzemi fermentálásban az előnyös szénhidrát forrás a glükóz, bár alkalmazhatunk melaszokat, keményítőt, laktózt, szacharózt, maltózt, glicerint és hasonlókat is. Az előnyös nitrogénforrás az enzimesen hidrolizált kazein és az oldható hús-pepton, alkalmazhatunk azonban szeszfőzőkben használt gabonamagvakat, mononátriumglutamátot és hasonlókat is. A táptalajhoz szervetlen sókat adhatunk. Ezek a szokásos olyan oldható sókat foglalják magukban, amelyek nátrium-, magnézium-, kalcium-, ammonium-, klorid-, karbonát-, szulfát-, nitrát- és hasonló ionokat szolgáltatnak. A táptalajhoz olyan esszenciális nyomelemeket is adhatunk, amelyek az organizmus növekedéséhez és fejlődéséhez szükségesek. Az ilyen nyomelemek általában olyan mennyiségben fordulnak elő szennyezőanyagként a táptalaj egyéb alkotórészeiben, amely elegendő ahhoz, hogy az organizmus megfelelően növekedjen. Ha a nagyüzemi fermentálás során a habzás problémát okoz, kis mennyiségű (például 0,2 ml/liter) habzásgátlószer, így poliprapilénglikol beadagolására van szükség. Nagymennyiségű A-30912 antibiotikum elegy előállításához előnyösen szubmerz aerob fermentációt végzünk tartályokban. Kismennyiségű A-30912 antibiotikum elegyet kaphatunk rázó-bmbikos kultúrával. Az antibiotikum előállításában tapasztalható lag fázis következtében, amely eljárás során általában az organizmus spóra alakjával inokuláljuk a nagy tartályokat, előnyös, ha vegetatív inokulumot használunk. A vegetatív inokulumot úgy állítjuk elő, hogy a táptalaj kis térfogat mennyiségét az organizmus spóraalakjával vagy micélium fragmenseivel inokuláljuk, hogy az organizmus friss, aktívan növekedő kultúráját kapjuk. Ezután a vegetatív inokulumot nagyobb tartályba visszük át. A vegetatív inokulum tenyésztéséhez használt közeg azonos lehet a nagyobb léptékű fermentációban alkalmazottal, lehet azonban attól eltérő is. Az A—30912 antibiotikumot termelő szervezetet körülbelül 20 C° és körülbelül 43 C° közötti hőmérsékleteken tenyészthetjük, jól növekszik körülbelül 25-30 C° hőmérsékleten. Az A-30912 antibiotikum elegy optimális termelése úgy tűnik, hogy körülbelül 25 C° hőmérsékleten tapasztalható. Az aerob, szubmerz tenyésztés esetében szokásos módon steril levegőt buborékoltatunk át a táptalajon. Az antibiotikus hatékony termelése céljából előnyös levegőmennyiség fermentorban végzett fermentáció esetén 0,4 térfogat levegő/térfogat táptalaj/perc (V/V/M) feletti. Az A—30912 antibiotikus elegy termelését a fermentáció folyamán oly módon követjük, hogy megvizsgáljuk a teljes táptalaj alkoholos extraktumának mintáit valamely, az A—30912 antibiotikummal szemben érzékenynek ismert organizmusra gyakorolt hatás szempontjából. Az A—30912 antitiotikum elegy jelenlétének meghatározására használható organizmus például a Candida albicans. A biológiai meghatározást kényelmesen elvégezhetjük beoltott agar lemezeken a papír-korongos módszerrel. Az antibiotikus aktivitást általában a fermentáció második napján mutathatjuk ki. Az antibiotikus aktivitás termelés általában körülbelül a harmadik és a hatodik nap között maximális. A fermentáció befejeztével az antibiotikum tar taloin 200 mcg/ml. Ennek körülbelül 10%-a található a tenyészlében, a maradék a sejtekhez kötődik. A fermentáció során a mintákat vagy úgy készíthetjük, hogy a sejttömeget a minta térfogatának megfelelő mennyiségű metanollal 15 percig extraháljuk, vagy egy térfogatnyi vett mintát két térfogatrész metanollal extrahálunk. Az A—30912 antibiotikumnak a fermentlében és a vett mintákban mutatott aktivitását agardiffúziós módszerrel mutattuk ki, melynek során Hansenula silvicola NRRLY—1678 élesztőtörzset használunk. Beoltott agardiffúziós lemezeket készítettünk, Nutrient agar táptalajt megfelelő koncentrációjú élesztőtenyészettel beoltva, majd 20 x 100 mm-es műanyag Petri-csészékbe egyenként 10 ml agart öntöttünk. Referencia anyagként egy A-30912 preparátumot használunk, mely 80—90%-ban A faktort tartalmazott. Ezt az anyagot használtuk az egység kifejezésére. A nagy tisztaságú A faktor 2500 E/mg fajlagos aktivitású volt. A standard dózisgörbét 60, 40 , 20 és 10 E/ml-nél vettük fel. A standard és minták hígítására metanol-víz (1 : 1) elegyet használunk. A mintákat és standard oldatokat automata pipettával 12,7 mm átmérőjű papír korongra vittük fel. A vizsgálati lemezeket 30 C° hőmérsékleten 40—48 órán át inkubáltuk. A gátlási zónák átmérőjét módosított Fischer Lilly antibiotikumzóna leolvasóval határoztuk meg. Az A—30912 antibiotikum faktorok gombaölőszerek. Az A—30912 antibiotikum faktorok gombaölő hatását in vitro kísérletekben az A, B, D és E faktorokkal szemléltetjük. Ezeket a vizsgálatokat az alábbi III. és IV. táblázatban foglaljuk össze. A gombaölő hatást a szokásos 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
