173410. lajstromszámú szabadalom • Javított baktériumtáptalajt és timidin-foszforilázt tartalmazó kompozició, baktériumok folsav-antagonistákkal szemben mutatott érsékenységének kimutatására, továbbá eljárás a kombozició és az enzim előállítására
9 173410 10 I. táblázat folytatása Eljárás Lépés száma Térf. (ml) Aktivitási egységek (ml) Teljes egységek száma Protein mg/ml Aktivitási egységek/mg prot. Term. % Tisztítások száma Eluátum a DEAE-ceüulózról III 52 80 500 4 186 000 0,61 132 000 60 50 Eluátum az ECTEOLA-ceüulózról IV 66 50 700 3 346 200 0,19 266 800 48 101 2. példa Szilárd táptalaj Mueller-Hinton (Wilson) agart készítünk a szokásos módon, majd autoklávban sterilezzük. A táptalajt ezután kivesszük az autoklávból, majd 50-55 C*-ra hagyjuk lehűlni. Ezután aszeptikus körülmények között hozzáadunk annyi 1. példa szerint előállított steril, tisztított timidin-foszforiláz-oldatot, hogy a végén 40 egység tisztított enzim/ml legyen a koncentráció. A kapott táptalajt erélyesen összekeverjük, majd steril Petri-csészékbe öntjük és szobahőmérsékletre hagyjuk hűlni. 3. példa Érzékenységi próba A szokásos módon készítünk Mueller-Hinton (Wilson) agart és Brain-Heart infúziós agart (Difco), és mindegyikből három sarzsot autoklávban sterilezőink. Miután kivettük az autoklávból, mindegyik közegből egy-egy sarzsot steril Petri-csészékbe helyezünk. A közegek másik két-két sarzsát hagyjuk lehűlni 50-55 C°-ra. Mindegyik közeg egy-egy 2Q sarzsához ezután annyi ló-vér-lizátumot adunk, hogy annak végső koncentrációja 5% legyen. Végül a közegek utolsó sarzsához annyi steril, 1. példa szerint előállított, tisztított timidin-foszforiláz-oldatot adunk, hogy a végén 40 egység tisztított 25 enzim/ml legyen a koncentráció. Minden egyes sarzsot erősen összekeverünk, majd steril Petri-csészékbe öntjük. Szobahőmérsékletre történő lehűlés után, mindegyik agar-táptalajt beoltunk 2 ml hígított (10-4) Escherichia coli Mueller-Hinton-táp- 30 Iá)en (Difco) éjszakán át kapott tenyészetével. A fölösleges folyadékot eltávolítjuk és a lemezeket száradni hagyjuk. Ezután a lemezek felületére szűrőpapír-korongokat helyezünk, amelyek 1,25 mg trimetoprimet, 1,25 mg trimetoprimet és 23,75 mg 35 szulfametoxazolt, illetve 23,75 mg szulfametoxazolt tartalmaznak. Az egészet ezután 37 C*on 16 órát inkubáljuk, és a végén nem egészen összefüggő baktérium-növekményt kapunk. Meghatározzuk a gátlási zónákat, amelyeket abban 40 a távolságban fejezünk ki, amelyet a korong szélétől a baktérium-mentes rész széléig mérünk. A II. táblázat összegezi az eredményeket. II. Táblázat Érzékenységi próba Közéé Hatást megfordító szer A zóna mérete mm-ben TMP TMP SMX + 1,25 Mg 1,25 Mg 23,75 Mg SMX 23,75 Mg Brain-Heart infúziós agar (Difco) Mueller-Hinton agar (Wilson) timidin-foszforiláz 40 egység/ml 5%-os ló-vér-lizátum Nü timidin-foszforiláz 40 egység/ml 5%-os ló-vér-lizátum Nü 22(25) 17(20) 26(31) 14(22) 12(20) 21(29) (22) (23) (31) 24(27) 24(26) 31(36) 25(28) 24(26) 31(35) (25) (26) (35) ( )-ben a részleges gátlásokat jelöltük. 5
