173215. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin, inzulin-analógok és inzulin- származékok előállítására
17 173215 18 A maradékot feloldjuk 50 ml 10%-os ecetsav-oldatban, majd négyszer 100-as Sephadex G 75 „finom” oszlopon kromatografáljuk- Az oszlop III általános képletű inzulin-N“A1NeB29-a,a-diamino-dikarbonsav-származékkal kalibrált. Az oszlopon „előcsúcs” (1,28 g) után megjelenik az „inzulincsúcs” (2,81 g). Az „előcsúcs” anyagát a fentiek szerint ditiotreitollal redukáljuk folyékony ammóniában és 1,5 liter vízben oxidáljuk 9-es pH-nál. A kromatografálás után kapót* 2,81 g III általános képletű inzulin1 2 9-a,a-diamino-dikarbonsrv-származékot 3 órán keresztül 60 ml 95%-os piridinben 40 °C-on 0,7 ml fenilmustárolajjal keverjük. Ezután bepároljuk a reakcióelegyet 10 ml-re és éterrel leválasztunk 2,4 g feniltiokarbamoil-vegyületet. Az eljárás ismétlése után a szárított terméket 2 órán keresztül 20 ml trifluorecetsavban hagyjuk állni 25 °C-on, majd 200 ml éter segítségével leválasztunk 2,2 g nyers inzulint. Újból Sephadex G 75-ös a fentiek szerint végzett - kromatográfiás tisztítás után olyan inzulin-frakciót kapunk, amelyből az inzulint a szokásos módon cinkklorid hozzáadásával és a pH 5,44e állításával amorf alakban leválasztjuk. A termék 1-2 napon belül kristályosodik. Óvatosan lecentrifugáljuk a ki-nem-kristályosodott részről, megismételjük a kristályosítást és így 1,38 g (22% az alkalmazott A-láncra vonatkoztatva) des-Phe®1 -inzulint (marha) kapunk, melynek biológiai hatékonysága 23—25 I. E./mg. Szabadalmi igénypontok 1. Új eljárás VIII általános képletű inzulin, inzulinanalógok és inzulin-származékok előállítására - ahol az A- és B-láncban egy vagy több amin osa v más amin osa vra lehet kicserélve, vagy pedig a láncok rövidítettek is lehetnek, Y” jelentése hidrogénatom, 1—4 szénatomos alkarnál-csoport vagy (1—4 szénatomos alkoxi)-karbonilcsoport — azzal jellemezve, hogy valamely IA általános képletű inzulin-A-lánc-származékot - ahol X jelentése valamilyen S-védőcsoport és A-lánc jelentése a fenti -valamely VII általános képletű aktív észterrel — ahol Z jelentése 4-nitrofenii-, 2,4,5-triklórfenil-, N-szukónimid-csoport, Boc jelentése terc-butoxikarbonil-csőport, és W jelentése -(CH2X>- csoport, ahol n = 0—4 és adott esetben egy -CH2- csoportot -S— vagy -S02- csoport helyettesíthet — kondenzálunk, és a kapott VI’ általános képletű kondenzációs terméket — ahol X, Z, W, Boc és az A-lánc jelentése a fenti — valamely IB általános képletű inzulin-B-lánc-szármázékkal, amelynek B29 lizin-csoportja szabad Ne-amino-csoportot tartalmaz -ahol Y jelentése hidrogénatom, 1—4 szénatomos alkanofl-csoport, (1—4 szénatomos alkoxi)-karbonil-csoport, valamely, a természetben előforduló a-amino®vból származtatható aminoacil- vagy Boc-aminoacil■ctoport, 1—4 szénatomos halogénalkanoil-csoport, előnyösen trifluoracetil-csoport, X és a B-lánc jelentése a fenti — kondenzálunk, és a kapott I általános képletű vegyületről — ahol X és Y jelentése a fenti, A- és B-lánc jelentése a fenti, R jelentése valamely II általános képletű csoport, ahol Boc és W jelentése a fenti - a Boc-védőcsoportokat, és kívánt esetben az Y = 1—4 szénatomos alkanoil-csoportot trifluorecetsawal lehasítjuk, majd az X-védőcsoportokat — ha X jelentése például szulfo-csoport tioglikol segítségével — lehasítjuk, majd levegő oxigénjével kezeljük, és a kapott III általános képletű inzulin-NaA1N® 9-a,a-diamino-dikarbonsav-származékból — ahol A- és B-lánc jelentése a fenti, Y’ jelentése hidrogénatom, (1-4 szénatomos alkoxi)-karbonil-csoport vagy Y fenti meghatározásának megfelelő aminoacil-csoport, R’ jelentése a Ua általános képletű csoport, ahol W jelentése a fenti — a —CO-R’—CO-hidat — ahol R’ jelentése a fenti - fenilizotiocianátos, majd savas - előnyösen trifluorecetsavas — kezeléssel lehasítjuk. (Elsőbbsége: 1973. október 25.) 2. Új eljárás VIII általános képletű inzulin-, inzulin-analógok és inzulin-származékok előállítására — ahol az A- és B-láncban egy vagy több amin osav más aminosavra lehet kicserélve, vagy pedig a láncok rövidítettek is lehetnek, Y” jelentése hidrogénatom, 1—4 szénatomos alkanoil-csoport vagy (1—4 szénatomos alkoxi)-karbonilcsoport -azzal jellemezve, hogy valamely IA általános képletű inzulin-A-lánc-származékot — ahol X jelentése valamilyen S-védőcsoport és az A-lánc jelentése a fenti — valamely VII általános képletű aktív észténél — ahol Z jelentése 4-nitrofenil-, 2,4,5-triklórfenil-, N-szukdnimid-csoport, Boc jelentése terc-butoxikarbonil-csoport, és W jelentése kénatom, —S—CH2— csoport vagy ezek szulfónjai, vagy —(CH2)„— csoport, ahol n = 0,1 vagy 2-kondenzálunk, és a kapott VI’ általános képletű kondenzációs terméket — ahol X, Z, W, Boc és A-lánc jelentése a fenti - valamely IB általános képletű in zulin-B-lánc-szár mázé kkal, amelynek B29 lizin-csoportja szabad Ne -amino-csoportot tartalmaz - ahol Y jelentése hidrogénatom, 1—4 szénatomos alkanoil-csoport (1—4 szénatomos alkoxi)-karbonil-csoport, valamely, a természetben előforduló a-aminosavból származtatható aminoacetil-csoport vagy Boc-aminoacil-csoport, X és a B-lánc jelentése a fenti — kondenzálunk, és a kapott I általános képletű vegyületről — ahol X és Y jelentése a fenti, A- és B-lánc jelentése a fenti, R jelentése valamely II általános képletű csoport, ahol Boc és W jelentése a fenti — a Boc-védőcsoport ókat, és kívánt esetben az Y = 1 —4 szénatomos alkanoil-csoportot trifluorecetsawal lehasítjuk, majd az X-védőcsoportokat - ha X jelentése például szulfo-csoport tioglikol segítségével - lehasítjuk, majd levegő oxigénjével kezeljük, és a kapott III 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
