173215. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin, inzulin-analógok és inzulin- származékok előállítására
3 173215 4 sekkel áthidalható távolsága. Azóta sikerült már a két amino-csoportot összekötni szukcinoil- illetve adipinoil-híddal. [FEBS letter 21,105 (1971)]. Ily módon új inzulin-származékok keletkeztek, amelyeket azonban nem lehetett már inzulinná visszaalakítani. A találmány szerinti eljárás ezzel szemben lehetővé teszi, hogy egy intramdekulárisan térhálósított molekulából regeneráljuk az inzulint, mivel a -CO-R’-CO- híd - ahol R’ jelentése a megadott - fenilmustárolajos, majd savas kezeléssel (Edman-féle lebontás) mindkét -CO- csoport felől könnyen lehasítható. A találmány szerinti eljárásnak és a találmány szerinti III általános képle tű inzulin-NaA1 N£ B2 9-a,a-diamino-dikarbonsav-származékoknak az az előnyük és értékük, hogy a külön szintetizált A- és B-láncokból jó kitermeléssel előállíthatok. A két lánc nagy hígításban végzett kapcsolásánál azt a funkciót töltik be, amit az inzulin biosztntézisénél a C-peptid, nevezetesen létrehozzák a képletnek megfelelő kapcsolást. [Z. Naturforsch, 18b, 1120 (1963), J. A. C. S. 86,930(1964)]. A lánc-kapcsolásra ezideig csaknem kizárólagosan alkalmazott módszer, amelyet a Seientia Sinica 10, 84 (1961) cikk szerint végeztek, kedvező körülmények között körülbelül 10%-os kitermelést eredményez. Ennek körülbelül 40%-át lehet kristályos formában nyerni. Néhány adat, amely nagyobb kitermelésekről számolt be, sohasem volt reprodukálható. A kapcsolás kitermelése eddig csak úgy volt növelhető, ha az A-láncot körülbelül 5-szörös mólekvivalensnyi feleslegben alkalmazták. Ezek a reakciókörülmények azonban nem gazdaságosak [lásd Advances Enzymology 33, 455 (1970)], és a kristályosítható anyag kitermelése még itt is igen alacsony. Ezzel szemben a találmány szerinti eljárás 1:1 lánc-arány mellett több mint 25%-os kitermelést biztosít. Ezen túlmenően a rosszul kapcsolódott termékeket, redukció után, újbóli kapcsolásnak vethetjük alá, mivel jelen esetben az A- és a B-láncok - egyelőre — a találmány szerinti hídon keresztül változatlanul már összekapcsolva maradnak. A találmány szerinti eljárás ily módon ipari szempontból is hasznosítható inzulin-szintézist jelent. A találmány szerinti eljárással az inzulinon kívül inzulin-analógok és inzulin-származékok is előállíthatok. Inzulin-analógok alatt olyan vegyületeket értünk, amelyekben egy vagy több aminosavat más, előnyösen egyszerűbb aminosavra cserélünk át, valamint olyan inzulin-vegyületeket, amelyeknek megváltozott, előnyösen rövidebb a láncuk. így például - mint ahogy az már ismert az irodalomból — az A-láncban Gin5 és Gin15 helyettesíthető Glu-val; Ser12, iyr14, Asn18 és Asn21 helyettesíthető Ala-val; Val10 Leu-val vagy valamely más hidrofób aminosawal; továbbá Tyr19 Phe-vel. [Hoppe Seyler: Z. Physiol. Chem. 348, 947 és 1715 (1967)]. A B-láncban Phe1, Val2, Asn3, Gin4, Hiss, Ser9, His10, Thr27 és Pro28 helyettesíthető egyszerűbb aminosavakkal, előnyösen Ala-val. Még a CysA7 és a CysB7 is helyettesíthető Ala-val. [Hoppe Seyler: Z Physiol. Chem. 349, 1431 (1968); 350,1480(1969); 351,263 (1970); 352, 1005 (1967)]. Inzulin-származékok alatt azokat a vegyületeket értjük, amelyek szubsztituált reakcióképes csoportokat tartalmaznak. így például a B-lánc amino-csoportja helyettesítve lehet - a 2 042 299 számú NSZK közrebocsátási iratban foglaltakkal analóg módon - valamely acil-csoporttal. Ugyanez érvényes a fentiekben definiált, inzulin-analógokra. A feltétel mindig az, hogy a szubsztituensek cseréje útján egyáltalán ne, vagy csak minimálisan csökkenjen az inzulin biológiai hatása. A kétfunkciós hídképző reagens alapját képező IV általános képletű dia min odikar bon savak - ahol R’ jelentése a Ha általános képletű csoport, melyben a W jelentése a megadott, előnyösen a következők: 2,5-diamino-adipinsav, 2,6-diamíno-pimelinsav, 2,7-diamino-parafasav, 2,8-diamino-azelainsav, 2,9-diamino-szebacinsav, lantionin, cisztationin, lantionin-szulfon (3,3-szulfo-dialanin), cisztationin-szulfon, (2,7-diamino-4-szulfo-parafasav), 2,7-diamino-4-tia-parafasav vagy 2,8-diamino-5-tia-azelainsav, illetve a vegyületek 4- illetve 5 szulfo-analógja. A szulfonokat előnyösen az N-acilezett tiakarbonsavakból állítjuk elő ismert módon hidrogénperoxiddal vagy például benzoepersawal. Mível ezek a vegyületek két aszimmetriacentrummal rendelkeznek, több sztereoizomer képződik, amelyek azonban nem kritikusak a találmány szerinti eljárás szempontjából. A hídképző amino-csoportjának átmeneti védelmére célszerűen a terc-butoxikarbonil-csoportot (Boc) alkalmazunk. Ha a B-lánc N-végződésű fenilalaninnal (Y=H) fejeződik be, úgy az Edman-féle lebontással végzett -CO-R’-CO-csoport eliminálására (hídkihasítás) során [lásd például Acta Chem. Scand. 283—293 (1950)] az egyidejűleg lehasadó N-végződésű Phe következtében Dea-PheB -inzulint kapunk. Ha azt akarjuk, hogy a Phe megmaradjon, úgy olyan B-láncot állítunk elő, amelyben Y=aminoacil-csoport, például Gly- vagy Ala-csoport és amely az Edman-féle lebontás során eliminálódik. Az X S-védőcsoportokként a már ismert csoportok szolgálnak, például tritil-, difenilmetil-, acetamido-metil- vagy tetrahidropiranil-csoport, továbbá alkilmerkapto-csoportok, például etil-, izopropil-, vagy terc-butilmerkapto-csoportok, és aminoetil-karbamoil-védőcsoportok - az 1 930 330 számú NSZK közrebocsátási iratban foglaltakkal analóg módon, valamint az etil-karbamoil-csoport. A szulfhidril-csoportok átmeneti védelmére a szulfo-csoport is szolgálhat, a szulfo-csoport például felesleges mennyiségű merkapto-vegyületek előnyösen tioglikol hatására távolítható el. A szulfo-csoportot előnyösen X-védőcsoportként alkalmazzuk az I általános képletű kiindulási vegyületekben, ahol Y és R jelentése a fenti, míg a többi, előbbiekben említett X-csoportokat előnyösen az I általános képletű vegyületek előállításához szükséges kiindulási vegyületeiben használjuk. A találmány szerinti eljárásnál például oly módon járunk el, hogy valamely ismert módon elkészített inzulin-A-lánc-szulfonátot fölösleges mennyiségű VII általános képletű aktív-észterrel — ahol Z, Boc és W a megadott jelentésű —, példáid a V képletű 4-nitrofenil-észterrel reagáltatjuk. Megfelelő oldószer e reakcióhoz a dimetilformamid vagy dimetilszulfoxid- A reakcióterméket valamely szerves oldószerrel, például 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
