172960. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Streptomyces fradiae törzsek pronáz termelésének fokozására és pronáz fermentációjára
7 172960 8 spóraszuszpenziót készítettünk, melynek spóraszáma 10® / ml volt. A spóratenyészet 0,5 ml-ével oltottunk 100 ml táptalajt (500 ml-es Erlenmeyer lombikban), melynek jele R—19/3, összetétele: 1,2% szójahszt, 2,5% kukoricaliszt, 1,2% kukoricalekvár (nedves), 0,36% NaCl, 0,6% CaC03, 0,5% pálmaolaj. A pH sterilezés előtt 6,7. A tenyészetet 28 C°-on 24 órán át inkubáltuk rázóasztalon (330 rázatás percenként, 40 mm átmérőjű kör kerületén). A tenyészetek beérése után azokat hűtőládában (—4)-(-15) C°-on lefagyasztottuk. Az így készített „oltóanyag” ’ly módon a termelőképesség csökkenése nélkül tárolható 1 -2 évig. A fentebb jelölt négy, valamint a P-102003 (OKI 00144/1975) jelű törzs fagyasztott oltóanyagainak 6-6 ml-ét beoltottuk 12 literes üvegfermentorba, mely ó liter R—19/3 jelű táptalajt tartalmazott. Hat liter/liter/perc átmenő levegő és 440 fordulat/perc keverés mellett 28 C°-on végeztük a tenyésztést, habgátlóként pálmaolajat alkalmaztunk. A 18-24 óra alatt kifejlődött tenyészet 300 ml-ét át oltottuk 6 liter fermentációs táptalajba, 12 literes üvegfermentorokba és az inokuluméval azonos körülmények között 68—72 óráig fermentáltuk. A fermentációs táptalaj összetétele PF jelzésű, összetételét az 1. példában részleteztük. A fermentáció 50. órájától két óránként meghatároztuk az enzimaktivitást. Mikor az enzim-szint állandósult, leállítottuk a fermentációt. Eredményeinket a 6. sz. táblázatban foglaltuk össze. A pronáz-aktivitást PÚK módszenei határoztuk meg. A kísérletek hármas parallelekben futottak, a táblázatban szereplő csúcsértékek a parallel ldsérleletekben kapott csúcsértékek átlagai. 6. példa Streptomyces fradiae PG—02702 jelű törzzsel (OKI 00145/1975) az 5. példa szerint végzett fermentációk eredményeképpen, a fermentlé 60 C*-on vákuumban való bepárlása és porlasztva-szárítása, illetve porlasztva szárítása révén 6000—8000 PUK/gramm specifikus aktivitású enzimkészítmény állítható elő. 7 7. példa Streptomyces fradiae PG-02702 jelű törzsből (OKI 00145/1975) az 5. példa szerinti oltóanyagot készítettünk. Az oltóanyag 100 ml-ével (1 lombik) 200 liter R—19/3 jelű táptalajt oltottunk (a táptalaj összetételét lásd az 5. példában). 4 lapátos, 270 fordulat/perc fordulatszámú keverővei ellátott 230 liter hasznos térfogatú köpenyes vaskészülékben végeztük el a fermentációt. A táptalaj pH értékét 50 C°-on 6,8-ra állítottuk, majd 125 C -on 60 perdg sterilezőink. 28C°-on beoltottuk a táptalajt a lombik tartalmának közvetlen befolyatásával, lángolás mellett. A hasznos mikroorganizmus tenyésztését 28C°-on 1 liter levegő/1 liter táptalaj/perc levegőztetéssel 0,5 att. túlnyomáson 24 órán át végeztük. Az oltásra kész inokulum tenyészet dehidrogenáz aktivitása 3 perc volt (aktivitás meghatározás: 4,0 ml tenyészlére 1 ml 0,04%-os metilénkék oldatot rétegezünk, összerázással egyidőben megindított stopperórán ?z elszíntelenedésig eltelt időt leolvassuk), pH-ja 6,9, mikroszkópi készítményben fejlett, pelyhes micélium volt látható. Az érett inokulummal 2000 liter PF jelű táptalajt oltottunk (a táptalaj összetételét lásd az 1. példában). A táptalaj pH-értékét 50 C°-on 40%-os nátronlúg oldattal 7,4-re állítottuk. Ezután 124-125 C°-on 60 percig sterilezőink. A 28 C*-ra lehűtött táptalajt oltottuk az előbbiekben leírt módon elkészített 200 liter inokulum-tenyészettel. A fermentációt 1 liter levegő/1 liter táptalaj percenkénti levegőztetéssel, 28 C°-on, 0,5 att. túlnyomás mellett vezettük. A fermentor 2 m3 hasznos térfogatú saválló acél keverős fermentor volt. A keverő elem átmérője a fermentor átmérőjéhez viszonyítva 0,6, fordulatszáma: 132—140 ford/perc volt. Levegő befúvó rendszer: 4 ágú csillag lira. A készülék szulfitszáma: 1,5—2,0mMól 02/liter/perc. Habzásgátlóként pálmaolajat vagy más, természetes eredetű, szintetikus, vagy félszintetikus habgátlót használtunk. Enzim-aktivitási meghatározásokat a 48. órától végeztünk. Desztillálható ammónia meghatározást oltás előtt és után, az első 24 órában 4 óránként, ezután 12 óránként és vágáskor végeztünk. Keményítő és redukáló cukor meghatározása az oltás előtti és utáni mintákból, mai i 2 óránként és vágáskor történt. A pH-értéket folyamatosan ellenőriztük. A fermentáció anyagcsere profilját a 7. táblázat mutatja. A fermentáció folyamán vett minták mikroszkópi vizsgálata alapján a következőket állapíthatjuk meg: A fejlődés során a sugárgombákra jellemző szerkezet figyelhető meg. 24 órás korra kifejlődik az első generáció, melyre a hosszú, egyenletes vastagságú, homogén plazmájú hifákból álló mia- Kum jellemző. A 24 órától kezdődően vékonyabb hifák megjelenése jellemzi a második generációt. A 36. órától jellegzetes öregedést tapasztalunk, amely a most már egyformán vastag hifákon belül morfológiai inhomogenitásban mutatkozik meg. Ebben az állapotban a készítmény ritkább részein jellegzetesen merev hifák láthatók. Fragmentáció nem lép fel. A termelt összes pronáz mennyiség 720,10* PÚK egység. A fermentlé nirózásával nyert termék specifikus aktivitása 4325 PUK/gramm. A visszanyert összes aktivitás 566. 10* PÚK. Kitermelés 78,6%. 8. példa A 4. példában leírt izolált PG—02702 jelű törzs (OKI-00145/75) spóraszuszpenzióját ismételt MNG 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
