172931. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens szubsztrátumok vagy enzimaktivitások meghatározására
3 172931 4 lúgos közeget igényel, például 25%-os nátriumhidroxid-oldatot, ami ugyancsak a szubsztrátumok és enzimek elbontásához vezet. A találmány feladata olyan eljárás kidolgozása szubsztrátumok vagy enzimaktivitások meghatározására redoxreakció, mint mérési reakció alkalmazásával, amelyet az aszkorbinsav nem zavar. A találmány szerinti feladatot úgy oldjuk meg, hogy a reakciókeverékhez aszkorbátoxidázt adunk. Az aszkorbátoxidáz katalizálja a következő reakciót: ,. _ aszkorbátoxidáz aszkorbinsav + 1/2 02 ---------------------► dehidroaszkorbinsav + H20. Az aszkorbinsavoxidázra vonatkozó irodalmi adatok alapján az volt várható, hogy ez az enzim nem alkalmazható a találmány szerinti célra. Valamennyi eddig előállított enzim-készítmény ugyanis hidrogénperoxidot termel mellékreakcióban. Ugyanakkor az aszkorbátoxidáz igen gyorsan inaktiválódik, amit az egyidejűleg képződött hidrogénperoxidnak tulajdonítanak (Biochemical Copper Proceedings Symposium Harriman New York 1965, 305-337. o.). Az elmondottak a maximális mértékben tisztított készítményekre is vonatkoznak, amelyek ultracentrifugálásnál és elektroforézisnél semmiféle szennyeződést nem mutatnak [Biochem. 4, 1362-1370 (1965)]. Az inaktiválódást a hidrogénperoxid képződésére vezetik vissza [Biochem. Biophys. Acta 56, 427-439 (1962)]. Az utóbb említett közlemény szerzőinek számításai szerint 1E aszkorbátoxidáz 1 mmól/liter aszkorbinsav-oldatban 0,7 • 10-2 mmól/1 H202-t képez. Ilyen aszkorbát-koncentrációk a minta-oldatokban gyakran előfordulnak. A képződött hidrogénperoxid minden további nélkül az enzimatikus reakció rendelkezésére áll, mint azt a kataláz példáján igazolták. A H202 fotometriás kimutatására szolgáló hidrogéndonátor + H202 p_°^ színezék + 2 H20 rendszerben körülbelül 20 cm2/ptmól moláris extinkciós koefficiensnél 0,14 extinkció-különbség az okozott hiba. Mivel a normál fotometriás reakciók mérési tartománya körülbelül 0,01 és 1,00 közötti, az okozott hiba megengedhetetlen. Hasonló módon jelentkeznek hibák olyan reakcióknál is, ahol hidrogénperoxid helyett szerves hidroperoxidokat és POD helyett hemoglobint vagy más oxidációs katalizátort alkalmaznak. Azonban eltekintve a hidrogénperoxid által előidézett hibától, az utóbb említett irodalmi közleményből ismert volt, hogy az aszkorbinsav átalakulása már jóval teljes eltávolítása előtt leáll. Ez különösen azoknál a redox-reakcióknál súlyosbító körülmény, amelyeknél hidrogénperoxid keletkezik, mivel a hidrogénperoxidnak egyrészt még gyorsítani kellene az enzim inaktiválódását és másrészt a hidrogénperoxidnak az aszkorbátoxidáz révén történő újraképződése teljesen áttekinthetetlen jelenségekhez vezet. így rendkívül meglepő, hogy a várakozással ellentétben az aszkorbát jelenlétén alapuló zavarokat az aszkorbátoxidáz hozzáadásával teljesen ki lehet küszöbölni, anélkül, hogy más zavarok jelentkeznének, amelyek az aszkorbát kiküszöbölésének előnyeit hatástalanílják. A találmány szerinti eljárást előnyösen enzimatikus reakcióknál alkalmazzuk, különösen olyanoknál, amelyeknél hidrogénperoxid képződik, tehát olyan reakcióknál, amelyeket oxidázok - így glukózoxidáz, uridáz, koleszterinoxidáz és hasonlók - katalizálnak, továbbá olyan reakcióknál, amelyeknél tetrazóliumsókat redukálnak és olyanoknál, amelyeknél fenolok nukleofil reagensekkel oxidative kapcsolódnak. Az aszkorbátoxidáz hozzáadott mennyisége a mintában várható aszkorbinsav menynyiségétől függ. Rendszerint 0,002-100 E aszkorbátoxidáz/ml előnyösen 0,01-30 E/ml vizsgált anyag mennyiséget alkalmazunk. A reakció pH-értéke elsősorban ahhoz a pH-értékhez igazodik, amely a résztvevő enzim vagy enzimek számára szükséges. A találmány szerinti eljárás számára megfelelőnek bizonyultak a 4,0 és 8,5 közötti pH-értékek. A találmány keretében különösen előnyösnek bizonyult a Zucchiniből (Cucurbita pepo medullosa) készített aszkorbátoxidáz alkalmazása, de egyéb eredetű aszkorbátoxidázok is alkalmasak. A találmány további tárgya reagens szubsztrátumok vagy enzimaktivitások meghatározására, amely szubsztrátum vagy enzim meghatározására szolgáló rendszert tartalmaz, mérési reakcióként redox-reakciót alkalmazva és amelyet az jellemez, hogy járulékosan aszkorbátoxidázt tartalmaz. Ezek közül az előnyös reagensek, amennyiben glükóz a meghatározandó szubsztrátum, peroxidázt, glükózoxidázt, o-dianizidint vagy azino-di-3-etil-benziltiazolin-szulfonát(6)-ot tartalmaznak puffénál, vagy hexokinázt, glükóz-6-foszfát-dehidrogenázt, diaforázt, NADP-t, egy tetrazóliumsót, mint az INT : 3-(4-jódfenil)-2-(4-nitrofenil)-5-fenil-2-H-tetrazóliumklorid, és puffert. Húgysav meghatározásánál a rendszer előnyösen peroxidázból, urikázból, egy fenolból, így például 2,4-diklór-fenolból, aminoantipirinből és pufferből áll. A glutamát-meghatározás esetében a rendszer előnyösen glutamátdehidrogenázból, diaforázból, NAD-ból, INT-ből és pufferből áll. Tirozin számára előnyösen tirozinázt, 3 - me til-6-káliumszulfonil-benztiazolon-hidrazon(2)-t, brenzkatechin meghatározására difenoloxidázt, 3-metil-6-káliumszulfonil-benztiazolon-hidrazon(2)-t alkalmazunk, mindig puffénál együtt. A szubsztrátumok meghatározására szolgáló említett rendszerek azonban ismertek. Ezek helyett azonban más ismert rendszerek is alkalmazhatók szubsztrátumok vagy enzimek meghatározására a találmány szerinti reagens keretében. Különösen jelentős a találmánynak a gyors diagnosztika területén való alkalmazása is. A gyors diagnosztikumok a különböző, az eljárás elvégzéséhez szükséges reagenseket rendszerint szívóképes hordozón impregnálva vagy alkalmas kötőanyaggal hordozófóliára bevonatként felvive tartalmazzák. Ennél az az előnyös kiviteli alak, hogy az aszkorbátoxidázt a többi reagens keverékéhez adjuk és ezt követően impregnáljuk a szívóképes hordozót. Ily módon aszkorbinsav által gyakorlatilag nem zavart tesztpapírok állíthatók elő például glükóz vizeletben való kimutatására (a 23 38 932 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali irat szerint), vérnek vizeletben való kimutatására (például a 24 60 903 számú 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
