172910. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés folyadékmiták vizsgálatára
7 172910 8 reakció-körülményeket állítunk be, s radioaktív beütésekről görbét veszünk fel minden egyes anyagra vonatkozóan, melynek a T—4 tartalmát ismerjük. A legkedvezőbb megoldás az, hogy a „standard” mintát a megfelelő 140 mélyedésekbe tesszük, ugyanazon a tárcsán, melyen az ismeretlen T-4 tartalmú test-mintákat helyeztük el és így a standard és a mérendő anyag adatait egyszerre megkapjuk. A 4. ábra bemutat egy olyan görbét, melyet az előbb ismertetett módon alkalmazni lehet. Ez mutatja a radioaktív beütések számát, melyet a standard kiindulási anyag esetében kaptunk percenként (természetesen a minta T—4 tartalma ismert). Példaként a 4. ábráról leolvasható különleges körülmények alkalmazására vonatkozóan az, hogy ha egy vizsgálandó szérum-min ta esetében, melyet a standarddal szemben mértünk 4000 beütést kaptunk, a kiindulási szérum-minta T—4 tartalma megfelelt 6,2 g T-4 anyagnak a minta 100ml-ére számítva. A jelen találmány kivitelezése során igen pontos reagens mennyiségeket kell használnunk. A találmány alkalmazható minden folyadék-folyadék reakció esetére, különösen azokra, melyek a klinikai gyakorlatban ismeretesek a vérszérum, vagy a szérumhoz hasonló anyagok meghatározására, az ezekhez a reakciókhoz használt reagensek alkalmazásával. A jelen találmányban meghatározott eljárás különlegesen alkalmas arra, hogy fiziológiailag fontos molekulákat, amelyek például a Clinical Chemistry 19. kötet 2. sz. 1973 (szerzők: D. S. Kelley, L. P. Brown és PK. Besch 146 oldal) kötetében megjelentek, meghatározhatók legyenek. A következő példa arra szolgál, hogy a jelen találmányt közelebbről is bemutassa. Példa Klinikai szérium-mintákat elemeztünk, hogy a bennük levő trioxin (T—4) mennyiséget meghatározzuk az 1., 2. és 3. ábrán bemutatott készülék segítségével, felhasználva a 4. ábrán levő standard görbét. Kilenc klinikai szérum mintát, mindegyiket párhuzamos bemérésekkel és öt, ugyancsak kontrollal bemért standardot elemeztünk. A kilenc klinikai minta T—4 tartalma ismeretlen, és az öt standard ismert, de egymástól külöiihöző volt. Ezeket a mintákat párhuzamosan elemeztük. A vizsgálatot úgy végeztük, hogy két-két külső 140 mélyedésbe töltöttünk az egyes szérumokból 35 mikrolitert. így megtöltve tizennyolc külső mélyedést, a mintálát 1,1’, 2,2’, 3,3’.. . 9,9’-el jelöltük, a 2. ábrának megfelelően. Ugyancsak két-két külső 140 mélyedésbe töltöttünk ötféle standard mintából 35 mikrolitert. Ily módon tíz külső 140 mélyedést vettünk igénybe, ezeket a kontroli-mintákat, a,a’, b,b’,... e,e’-el jelöltük meg a 2. ábrán. A „standard minták” oldatainak T-4 tartalma az alábbiak szerint volt: Standard T-4 (egm 100 ml) a 0 b 2 c 6 d 12 e 30 A fentiekben ismertetett betöltés a külső mélyedésekbe úgy történt, hogy minden 35 mikroliter anyagot 65 mikroliter desztillált vízzel kevertünk össze. Ezek után minden külső 140 mélyedésben levő anyaghoz adtunk 50 mikroliter radioaktív T—412SJ oldatot, melynek elkészítési módját az alábbiakban fogjuk ismertetni. A belső 130 mélyedéseket 10,10’,... 90,90’, és A,A’.. . E,E’-vel megjelölt antitesttel töltünk meg (ezeknek az elkészítését alább fogjuk ismertetni). A 15 tárcsát hirtelen felgyorsítottuk olyan első sebességre, hogy a belső 130 mélyedések 10,10’... 90,90’ és az A,A’... E,E’ antitestjei mintegy 3 másodpercen belül átkerüljenek a centrifugális erő hatására a 1,1’... 9,9’ és a,a’... e,e’ anyagokat tartalmazó külső 140 mélyedésekbe, amelyekben a reakció elkezdődik és tart 30 percen keresztül. T4+AB AB • T4 t4+AB AB • T4 A harminc perc eltelte után a 15 tárcsa forgási sebességét hirtelen második sebességre emeltük és a fellépő centrifugális erő a 130 és 140 mélyedések tartalmát átnyomta velük összeköttetésben álló 200 gél oszlopokra. 15 másodperccel azután, hogy a 15 tárcsa sebességét a második fokozatra emeltük, az 1. ábrán bemutatott 220 szivattyút üzembe helyeztük az ismert 212 időzítő segítségével, azért, hogy 2 ml puffer-oldatot juttasson minden egyes belső 130 mélyedésbe a 222 tartályból. (A puffer-oldat összetételét az alábbiak során fogjuk ismertetni.) összesen 60 ml oldatot továbbítottunk, oly módon, hogy percenként 30 ml volt a folyadék mennyisége, a teljes folyadékmennyiséget úgy osztottuk meg, hogy minden mélyedésbe 2 ml jutott. A 240 adagolóból ily módon bevezetett folyadékot a centrifugális erő átnyomja a 10,10’... 90,90’ és A,A’. .. E,E’ anyagot tartalmazó belső 130 mélyedésekből, illetve az 1,1’ - - - 9,9’ és a,a’...e,e’ mintákat tartalmazó külső 140 mélyedésekből a 200 gél oszlopokra, ahol a reakció-terméket és a reaktánsokat eluáljuk, centrifugális erő segítségével. A folyamat eredményeként a T—4 antitest-komplex, mely a radioaktív és a nem-radioaktív T—4-t tartalmazza, valamint a nemreagált antitest, gyorsan - egy percen belül - eluálódik a 200 gél oszlopról, majd a centrifugális erő hatására bekerül a 65 kémcsövekbe. A nem reagált T—4 * oldat és a szérum kis molekulasúlyú összetevői visszamaradnak a kromatográfiás 200 gél oszlopon. A jelen példa során, az antitest eluációs elkülönítése után a fent jelzett reakciót lényegében megállítjuk az elkülönítés időpontjában, minden egyes kromatografáló-oszlo-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
