172778. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens valamely szubsztrátum koncentrációjának enzimkinetikus meghatározására
11 172778 12 húgysav) csak 0,002 extinkciót lehet elérni 12,6 cm2/pmól húgysav extinkciós koefficiensre vonatkoztatva 293 nm-nél (Boehringer Mannheim GmbH, Testfibel, 3. kiadás, 1969, Húgysav fejezet). Az eljárás kinetikus meghatározásra túlságosan érzékeny. Baktériumos urikáz alkalmazása által a kezdeti koncentráció bár 6 faktorral növelhető, megfelelő érzékenység mégis csak akkor adódik, ha az első mérési pontot a reakció indulása után már 4 másodperccel felvesszük és a választott „time fixed”-intervallum >1,5 perc (Tiffany említett munkája). Káliumtiocianáttal egy megfelelő kompetitiv inhibitort találtunk (egyenlő ordinátametszéspont Lineweaver-Burk szerinti felvételnél egyenlő enzimaktivitás), amely 687 mmól/liter vizsgálati oldat koncentrációnál 1 mmól/liter látszólagos Michaelis-állandót adott. Ezzel 50pliter higítatlan próba és 600 pliter vizsgálati térfogat alkalmazása esetén 0,05 cs/Km érték adódik 0,6 mmól/liter húgysav koncentrációra a próbában, így a kalibrációs görbe érzékenysége és egyenes volta tekintetében az előfeltételek adottnak látszanak egyszerű sorozatvizsgálatra. Ezzel a számitással megegyezően a szögleolvasásra 20 mp-nél a tangens és vízben 0,6 mmól/liter húgysav koncentrációkig terjedő mennyiségek között -3%-os hibával rendelkező arányosságot találtunk a legnagyobb anyagtartalom esetére, amely elfogadható, ha a körülmények szérumelemzésre való átvitelére gondolunk. A szög az alsó normál-értékhatáron az adott körülmények között körülbelül 8°-nak adódott, így az eljárás érzékenysége kis anyagkoncentrációkra is kiterjed. A vizes húgysav-oldatokra talált körülmények ezzel szérumelemzésnél is alkalmazhatók. Mindenesetre az urikáz adagolása előtt az üresjáratot célszerű megvárni, amely a szérumban, változó mennyiségben jelenlevő aszkorbinsav oxidációjának a függvénye. Az inhibitor-koncentráció növelése útján a lineáris méréstartomány kiterjeszthető és a pontosság nagyobb húgysavkoncentrációknál növelhető, mimellett egyidejűleg az érzékenységet 293 nm mérőhullámra való átmenet és/vagy az enzimaktivitás további növelése és/vagy a hőmérséklet emelése útján célszerű javítani. 2. példa A glükóz fotometriás meghatározása a glükóz-dehidrogenáz módszer szerint A következő ismert reakció játszódik le: a-glükóz mutarotáz (EC 5.1^3) /?-glükóz 0-D-glükóz + NAD° glükóz-dehidrogenzáz (EC Î.1.M7) sav + NADH + H° glükuron-Eszközök Eppendorf enzimmérőhely 5086 (kinetikus meghatározások), 5 Eppendorf anyagmérőhely 5091 (végértékmeghatározások), Eppendorf pipetták, illetve Eppendorf próba-reagens-adagolók (mikroliter tartományban), hitető lesített pipetták (milliliter tartományban). Knick-féle labor-pH-mérő. Diehl-féle Combitron S asztali számító, középérték számára programmal, ugyancsak szabványelhajlásra és variációs koefficiensre, valamint különprogram (Archív-Nr. 10 344) 15 lineáris regresszióra, korrelációs koefficiensre és a regressziós egyenes körüli szórásra. Reagensek 20 1. káliumtiocianát 2. káliumklorid 3. etiléndinitrilotetraecetsav-dinátriumsó 4. D(+)-glükóz, vízmentes, puriss. 25 5. vizes glükóz-szabványoldat 6. nikotinamid-adenin-dinukleotid, szabad sav (150mg/ml H20) 7. „vércukor, GlucDH-módszer” (próbacsomag Merckotest) 30 Oldatok 1. puffer: 120 mmól/liter foszfátpuffer, pH 7,6 35 2. puffer-enzim-elegy: glükóz-dehidrogenáz és mutarotáz pufferrel készített oldata, előállítás a mintacsomag kísérőutasításának megfelelően történik 3. stabilizált puffer-enzim-inhibitor-elegy: 825 mmól káliumtiocianát és 55 mmól etiléndinitrilotetra-40 ecetsav-dinátriumsó 1 liter puffer-enzim-eleggyel készített oldata. pH-érték 6,6. Munkamódszer 1. Glükóz-dehidrogenáz-aktivitás jellemzése: 20 pl 1 + 10 pufferrel hígított puffer-enzim- 50 -elegyet 500 pl 280 mmólglükoz/1 puffer oldattal (nagyobb glükózkoncentrációknál anyaggátlás) 25 C°-on inkubálunk és az extinkciő-növekedés sebességét követjük három percen keresztül 20 pl 150 mmól/1 NAD® hozzáadása után. 55 Számítás és eredmény (e = mólextinkció NADH, d = rétegvastagság, EV = vizsgálati térfogat, PV = mintatérfogat, F = hígítási faktor): 60 AE 103 EV U/ml *---------------perc • d PV F = 65 = 0,205 103 540 3,3 103 1,00 20 11 = 18,5 6
