172778. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens valamely szubsztrátum koncentrációjának enzimkinetikus meghatározására
3 172778 4 1. Az időszükséglet a megfelelő végért ékmeghatározáshoz viszonyítva mindenkor kevesebb. 2. A vakérték felvétele többnyire nélkülözhető, ezzel a munkamenetek száma a kísérleti oldatok adagolásánál, a mintaanyag- és reagensfelhasználás, valamint adott esetben a készülék-szükséglet számítógépkiértékelésnél csökkenthető. 3. A szubsztrátum meghatározás az enzimaktivitás meghatározásánál alkalmazott szokásos eszközökkel történhet. Ezzel az eszköztechnikai okokból eddig nehezen kombinálható meghatározások egyidejű végrehajtása is lehetségessé válik. 4. Egycsöves küvetták alkalmazása korlátlanul lehetővé válik. Ezek használata útján a fotometrikus méréseknél a küvettára tapadt anyagok által okozott hibák és az öblítési műveletek kiküszöbölődnek, mivel a küvetták különböző sajátextinkciói miatt nem léphetnek fel hibák. Mindezeknek a nyilvánvaló előnyöknek ellenére a gyakorlatban mindezideig nem váltak szokásossá enzimkinetikus anyagmeghatározások és csak kivételes esetekben hajthatók végre célszerűen. Az ismert enzimkinetikus módszer (,initial rate” „mérőmódszer” melynél a reakció kezdeti sebességét mérik, vagy az eljárás, melynél egy előzőleg meghatározott időintervallumot mérnek) csak a kutatásnál játszanak szerepet. Ezek közös vonása az, hogy csak nagyon kis szubsztrátum koncentrációk alkalmazhatók és ezzel csak nagyon kis szubsztrátum átalakulások mérhetők. A vizsgálandó oldatban a nagyon kis szubsztrátum koncentrációkra való korlátozódás azért szükséges, mert csak így adódik egyenes arányosság, azaz egy egyenesvonalú kalibrációs görbe, a meghatározandó szubsztrátum és a reakciósebesség között, amelyre sorozatmeghatározásoknál feltétlenül szükség van. Enzimatikusan katalizált reakciók sebességére ugyanis a Michaelis-Menten-egyenlet érvényes, amely a következő módon írható le: vmax • CS v ----------------cs+Km Ebben a képletben v = reakciósebesség, vmax= = legnagyobb sebesség a szubsztrátum telítettség tartományában, cs= szubsztrátumkoncentráció, Km= Michaelis-állandó. Ennek az egyenletnek alapján a v reakciósebesség és a c§ szubsztrátumkoncentráció között csak akkor jöhet létre arányosság, ha cg nagyon kicsi KM-hez képest. A nevezőben levő cg tag ekkor elhanyagolhatóvá válhat, így kinetikusán egy pszeudo-elsőrendű reakció adódik. Ahogy elméleti megfontolások mutatják, cs értéke legfeljebb 0,2 Km lehet ahhoz, hogy kinetikus meghatározások céljára az analitikai hibákat még elfogadható értéken tarthassuk. K« maga a legtöbb reakcióra nagyon kicsi és 10~5-10~* mól/liter nagyságrendben van. Ebből adódik, hogy a mérések az eddigi eljárások szerint rendkívül kis szubsztrátum koncentrációk használatára korlátozódnak. Ezt a nehézséget azzal igyekeztek kikerülni, hogy lehetőleg nagy Km értékű enzimeket alkalmaztak. A rendelkezésre álló választék azonban csekély és a Km-értékek a gyakorlatban megfelelő szubsztrátum meghatározásokra rendszerint a legkedvezőbb esetben is túlságosan kicsik (kivételt jelent — ahogy az előzőekben említettük — a glükózmeghatározás glükóz-oxidázzal). Az elmondottak alapján az ismert enzimkinetikus eljárásoknál a következő hátrányok jelentkeznek: 1. Rendkívül pontos, nagy feloldóképességű és drága mérőeszközökre van szükség, mivel a mérési eredmény nagyon kis szubsztrátum-átalakulásoknál a hagyományos eszközök, például fotométerek, tartományában van. 2. A próbák koncentráció-spektrumának csak a kis része mérhető előzetes hígítás nélkül. Előzetes hígítás többnyire hibákat rejt magában és az elemzést meg kell ismételni. 3. Szennyrészecskék és légbuborékok nagyon meghamisítják a mérési eredményt, a gyakorlatban a megkövetelt rendkívül tiszta munkakörülményt nem lehet mindig megteremteni. A találmánynak az az alapja, hogy olyan eljárás kidolgozása vált szükségessé, amely a szubsztrátum koncentrációk egyszerű, gyakorlati kivitelezésre is alkalmas enzimkinetikus meghatározását lehetővé teszi és az eddigi eljárásokat oly mértékben javítja, hogy azok általánosan alkalmazhatókká válnak és gyakorlatilag elfogadható időben végrehajtható méréseket engednek meg, valamint egy nagyobb koncentráció-tartományban való mérést tesznek lehetővé külön előzetes hígítás nélkül. Ezt a feladatot a találmány értelmében valamely szubsztrátum, különösen egy a vérszérumban vagy a vérplazmában oldott vagy szuszpendált szubsztrátum koncentrációjának enzimkinetikus meghatározásához alkalmas eljárás kidolgozásával oldottuk meg, amelynek során egy vagy több szubsztrátum fajlagos enzimet adunk a szubsztrátumhoz és az enzimatikus reakció sebességét mérjük. Az eljárásra az jellemző, hogy legalább egy, az enzimatikus anyagátalakulás sebességmeghatározó lépésével összehangolt, kompetitiv inhibitor adagolásával a cs anyagkoncentrációnak a Kfa látszólagos Michaelis-álíandóhoz való arányát <0,2 :1 értékre állítjuk be, ezáltal a körülményeket egy pszeudo-elsőrendű reakcióhoz állítjuk be, a keveréket homogenizáljuk, előre meghatározott időközökben egy az átalakulásra fajlagos reakcióparaméter változását megállapítjuk és ebből a szubsztrátum koncentrációt kiszámítjuk. A találmány szerinti eljárásnak az az előnye, hogy a szubsztrátum koncentrációja enzimatikusan igen rövid idő alatt mérhető, míg eddig a reakció teljes lefolyását — ami bizonyos körülmények között egy óráig is eltartott - meg kellett várni. Ezzel szemben a találmány szerinti eljárás alkalmazásánál S perc teljesen elegendő. Ezáltal a méréshez szükséges idő igen nagy mértékben csökkenthető, and különösen kórházaknál, élelmiszeranali-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
