172712. lajstromszámú szabadalom • Eljárás félszintetikus cefalosporinok enzimes szintézisére oldhatatlan penicillinaciláz segítségével
3 172712 4 d) A szál által körülvett enzim folytonos újrafelhasználhatóságának lehetősége, ami nyilvánvalóan előnyösen befolyásolja az eljárás gazdaságosságát. A reakció egyrészt a 7-amino-3-metil'Cef-3-em-4- -karbonsav vagy a 7-amino-cefalosporánsav kiindulási anyag és olyan fenil-glicin vagy p-hidroxi-fenil-glicin között megy végbe, amelynek karboxilcsoportját a reakció meggyorsítása céljából valamely észterrel vagy amiddal aktiválhatjuk. A reakciót 0C° és 50 C° közötti, előnyösen 25 C° körüli hőmérsékleten és 4,0 és 9,0 közötti, előnyösen 7 körüli pH-értéken folytatjuk le. A reakciót oly módon hajtjuk végre, hogy az enzimet tartalmazó szálat érintkezésbe hozzuk a reakciókeverékkel. Minthogy heterogén rendszerrel állunk szemben, az érintkezés intenzitásának növelése és a határfelületi rétegben egyes káros diffúziós jelenségek elkerülése érdekében erőteljes keverést biztosítunk. A reakció megvalósítására különböző reaktortípusok alkalmazhatók. Az általunk használt igen egyszerű reaktor az enzimet tartalmazó szállal töltött oszlopból állott, amelyen át az oldatot szivattyúval tartottuk keringésben. Az áramoltatás sebességét úgy választottuk meg, hogy az a lehető legnagyobb konverziót biztosítsa. Az alábbi példák az oltalmi kör korlátozása nélkül kívánják a találmány szerinti eljárást részletesebben bemutatni. 1. példa Escherichia coli ATCC 9637 jelzésű törzsből penicillin-a cilázt kivonatolunk és tisztítunk, majd a tisztított enzimet a 836 462 lajstromszámú olasz szabadalmi leírásban ismertetett módszer szerint cellulóz-triacetát szálba építjük, ágyazzuk be oly módon, hogy az így előkészített szálak polimer grammonként kb. 25 000 enzim egységet tartalmazzanak (1 egység = 1 mmól hidrolizált G-penicillin óránként, 37 C° hőmérsékleten). 500 mg (2,33 mmól) 7-amino-3-metil-cef-3-em-4- -karbonsavat (7-ADCA) és lg (4,97 mmól) D(-)-fenil-glicin-metilészter-hidrogén-kloridot (PGM) 25 C°-on feloldunk 50 ml 0,1 mólos, 7,00 pH-jú kálium-foszfát puffer-oldatban. Ezt az oldatot keverés közben érintkeztetjük a köpennyel ellátott üvegcsőben elhelyezett, 1 g cellulóz-triacetátnak (CTA) megfelelő 2 g szállal. Szabályos időközönként spektrofotométeres módszerrel (Analyst, 92, 247, 1967) ellenőrizzük a 7-0-(2’-amino-2’-fenil-acetamido)-3-metil-cef-3-em4-karbonsav (cefalexin) tartalmat. 1 óra elteltével a szálról leürítve a reakciókeveréket, megállítjuk a reakciót. Az oldatban mért cefalexin koncentráció ekkor 8,4 mg/ml, ami 51% oS 7-ADCA konverziónak felel meg. 2. példa Az 1. példában leírt módszerrel 7-ADCA és PGM oldatot készítünk, az oldat pH-ja azonban ezúttal 6,50. 2 óra elteltével a reakciót a fent említett módon szakítjuk meg. Az oldat cefalexin tartalma ekkor 8,1 mg/ml, ami 49%-os konverziónak felel meg. 3. példa A 7-ADCA és a PGM oldatát az 1. példában ismertetett módszenei készítjük el, azonban azzal az eltéréssel, hogy az oldat pH-ja 8,50. A reakciót a már leírt módon kb. 30 perc múltán szakítjuk meg. Az oldatban 7,8 mg/ml cefalexin tartalmat találunk, ami 47%-os konverziónak felel meg. 4. példa 500 mg (2,33 mmól) 7—ADCA-t és 2 g (9,94 mmól) PGM-et 50 ml 0,2 mólos, 7-es pH-jú kálium-foszfát pufferben oldunk. Ezt a 25 C°-on termosztált oldatot keverés közben 1 órán át érintkeztetjük 2 g szállal. A reakció megszakítása után az oldatban a cefalexin mennyisége 12 mg/ml, ami 73%-os 7—ADCA konverziónak felel meg. 5. példa Az oldatot a 4. példában ismertetett módszer szerint készítjük el, és azt 37 C° értéken állandósított hőmérsékleten keverés közben 2 g szállal érintkeztetjük. A reakciót 30 perc után szakítjuk meg. Az oldatban a cefalexin mennyisége 11,4 mg/ml, ami 70%-os konverziónak felel meg. 6. példa 500 mg (2,33 mmól) 7-ADCA-t és lg (5,1 mmól) p-OH-PGE-t - D(-)-p-hidroxi-fenfl-glicin-etilészter - feloldunk 150 ml 25 C° hőmérsékletű, 0,1 mólos, 7,00 pH-jú kálium-foszfát kiegyenlítő oldatban. 4 óra elteltével a reakciót a már ismertetett módon szakítjuk meg. A reakciókeverékben 2 ng/ml 7-0-{2’-amino-2’<4-hidroxi-fenil)-acetamido] -3-metil-cef-3-em-4-kirbonsavat találunk, ami 35,4%-os konverziónak felel meg. 7. példa 535 mg (2,5 mmól) 7-ADCA-t és 873 mg (2,5 mmól) a-amino-benzü-penicillint (ampidDint) feloldunk 50 ni 25 C° hőmérsékletű, 0,1 mólos. 7,00 pH-jű kálium-foszfát kiegyenlítő oldatban, és az oldatot keverés közben 1 g szállal érintkwtétjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
