172644. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cef-3-em-4-karbonsav-származékok előállítására
5 172644 6 A találmány szerinti eljárásban előnyösen a cefalosporin C-vel rokonszerkezetű (I) általános képletű vegyületekből indulunk ki, azaz olyan 3-acilamido-cef-3-em-4-karbonsav-származékokat hidrolizálunk, ahol R3CO-acetil-csoportot jelent. Az (I) általános képletű vegyületekben R2 előnyösen hidrogénatom, míg B előnyösen =S csoport lehet. Az észteráz-termelő élesztő-mikroorganizmust általában fagyasztva szárított állapotban, zárt üvegampullákban tároljuk. A fagyasztva szárítás során a mikroorganizmus 2 vegyes % lefölözött tejport (Dífco) tartalmazó vízzel képezett szuszpenziójából indulunk ki. A fagyasztva szárított tenyészetet felhasználás előtt steril vízzel elegyítjük. Az így kapott, újra szuszpendált mikroorganizmusokat például tenyészthetjük, hogy a mikroorganizmusokat szilárd táptalajra, például 2 vegyes % glükózt, 1 vegyes % élesztőkivonatot, 1 vegyes % peptont, 0,5 vegyes % kálium-dihidrogénfoszfátot és 2 vegyes % agart tartalmazó, 5,6 pH-értékű vizes közegre oltjuk. A felszíni tenyészetet például 25 C°-on tenyésztjük mindaddig, amíg a mikroorganizmus be nem borítja az agar-felületet. Az így kapott tenyészetet alacsony hőmérsékleten, például 5 C°-on hónapokig eltarthatjuk. A mikroorganizmusokat szubmerz tenyészetben is növeszthetjük, a tenyésztést rendszerint 25 C°-on végezzük. Ebben az esetben például ügy járunk el, hogy a felszíni tenyészet mintájával folyékony táptalajt — például a fentinek megfelelő összetételű, azonban agart nem tartalmazó vizes közeget — oltunk be. Rendszerint előnyösen járunk el úgy, hogy a mikroorganizmust folyékony közegben tartjuk fenn, és ezt az elegyet oltóanyagként alkalmazzuk a további folyékony tenyészetek, például termelő tenyészetek beoltásához. Ezzel az eljárásmóddal kiküszöbölhetjük a felszíni — folyékony tenyészet-átoltások szükségességét, és ez az eljárás nagyobb mennyiségű inokulum felhasználására is lehetőséget biztosít. A további folyékony tenyészeteket megfelelő ideig - rendszerint 25 C°-on körülbelül 3 napig — inkubálva a 3-aciloximetil-cef-3-em-4-karbonsavak dezacilezéséhez felhasználandó észteráz forrásaként alkalmazható élesztő-szuszpenzióhoz jutunk. Az észteráz-képződést egyes esetekben fokozhatjuk, ha a folyékony táptalajhoz indukáló anyagot adunk. Indukáló anyagként például cefalosporin C-t vagy cefatosporin-C-sókat (így alkálifémsókat, például a megfelelő káliumsót) alkalmazhatunk. A cefalosporin-C káliumsója 0,1 vegyes %-nál kisebb mennyiségben is hatásos indukálószernek bizonyult. Az indukálószert rendszerint sterilizálás után adjuk a folyékony táptalajhoz. A cefalosporin-C-t és sóit például baktériumszűrőn átbocsátva sterilizálhatjuk, míg a folyékony táptalajt sterilizálás céljából például 15 percig körülbelül 121 C°-on és 10 500 kg/m2 nyomáson tarthatjuk. A 3-aciloximetil-cef-3-em-4-karbonsavak hidrolíziséhez az észterázt különféle formákban használhatjuk fel. Eljárhatunk például úgy, hogy a kiindulási anyaghoz észteráz-forrásként közvetlenül a folyékony tenyészetet adjuk, beadagolás előtt kívánt esetben a tenyészetben levő élesztő-sejteket ismert módon, például ultrahang-kezeléssel vagy sejtbontó enzimek felhasználásával elroncsoljuk. Észteráz-forrásként a roncsolt sejteket tartalmazó szuszpenzió vizes extrahálásával kapott oldatot is felhasználhatjuk, azonban a folyékony tenyészetből szűréssel elkülönített teljes sejteket vagy a folyékony tenyészet szűrletét is alkalmazhatjuk. Ha észteráz-forrásként a folyékony tenyészet szűrletét kívánjuk felhasználni, szűrés esetén a sejteket például a korábban ismertetett módszerekkel elroncsolhatjuk. Különösen előnyösen járunk el, ha észteráz-forrásként teljes sejteket alkalmazunk, ugyanis a teljes sejtek (például szuszpenzió formájában) könnyen elkülöníthetők a folyékony tenyészettől, és szárított állapotban vagy mélyhűtött pép formájában könnyen eltarthatok. A szárított vagy mélyhűtött teljes sejteket közvetlenül hozzáadhatjuk a hidrolizálandó kiindulási anyagot tartalmazó reakcióelegyhez. További előnyt jelent, hogy a sejtek- például szűréssel — könnyen elkülöníthetők a reakcióéi egyből a hidrolízis lezajlása után. Az így elkülönített sejteket — például vizes mosás után - újból felhasználhatjuk 3-aciloximetil-cef-3-em-4-karbonsav-származékok hidrolíziséhez. Azt tapasztaltuk, hogy a teljes sejtek még hét hidrolizálási lépéshez újra felhasználva is megfelelő észteráz-aktivitást fejtenek ki, és állandó hozammal szolgáltatnak jó minőségű hidrolizált termékeket. Ennek megfelelően gazdasági szempontból a teljes sejtek felhasználása rendkívül előnyös. Kívánt esetben a teljes sejteket felhasználás előtt közömbös hordozóanyagba — például polimerbe vagy membránba - ágyazhatjuk be, ahol a sejtek kovalens kötéssel kapcsolódnak a szervetlen vagy szerves polimerhez, vagy a sejteket rostos anyagokra vihetjük fel. Ezzel az eljárással egyrészt védhetjük a sejteket, másrészt az újrafelhasználáskor jelentkező veszteségeket a minimumra csökkenthetjük. A sejtek beágyazásához közömbös hordozóanyagként előnyösen poliakrilamid-gélt használunk. Az észterázt továbbá szilárd formában is felhasználhatjuk. A szilárd észterázt például úgy állíthatjuk elő, hogy a folyékony táptalaj szűrletéhez vagy vizes extraktumához megfelelő fehéije-kicsapószert, például sót vagy oldatot adunk. Az így kapott szilárd észterázt közvetlenül vagy előzetesen vízben oldva adhatjuk a reakcióelegyhez. A szilárd észterázt továbbá immobilizált állapotban — például oldhatatlanná tett származéka formájában, beágyazott állapotban vagy közömbös hordozóanyagra felvíve - is felhasználhatjuk. így például a folyékony tenyészet extraktumát vagy az egyszer már kicsapott észteráz oldatát olyan, egyébként közömbös szerves vagy szervetlen polimerrel hozhatjuk érintkezésbe, amely az észterázzal kovalens kötéseket képez, vagy az észterázt rostos anyagba, membránba vagy polimerbe, például poliakrilamid-gélbe ágyazhatjuk, ioncserélő gyantán abszorbeáltathatjuk, vagy hordozóanyaggal beburkolva — például gyöngy formájában — használhatjuk fel. Az ilyen típusú immobilizált észterázokat előnyösen oszlopba töltjük, és az oszlopon folyamatosan 3-aciloximetil-cef-3-em-4-karbonsavat áramoltatunk át. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
