172619. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimes analizishez
9 172619 10 3 1. sz. reagens (1,0 ml/min) 4 levegő (0,2 ml/min) 5 levegő (0,2 ml/min) 6 2. sz. reagens (1,0 ml/min) 7 dializátor 8 melegítőkészülék vagy 25 C° szobahőmérséklet 9 fotométer 10 reaktor (hordozóhoz kötött LDH) 11 elfolyás. A következő reagensek szükségesek: 1. reagens: 1 mM Trisz/HCl puffer, pH = 7,8, 5 mM piruvát! 0,1% detergens 2. reagens: 0,075 M trietanol-amin puffer, pH = 7,8, 1 mM magnézium-szulfát, 3,5 mM NAD, 0,455 mM ATP, 0,455 mM ATP, 1 E/ml HK, 1 E/ml G-6-P-DN (Leuconostoc mikroorganizmusból előállítva), 0,1% detergens. A reaktor 2 m hosszú csőből áll, amelynek belső felületére körülbelül 4 E/m LDH-t rögzítettünk. A csőben a következő reakció megy Végb6: TDH Piruvát ♦ NADH -==-*2 laktát ♦ NAD Tehát a glükózkoncentráció függvényében képződött NADH NAD-dá alakul vissza. A reakcióhoz szükséges piruvát a primer körből dialízis útján diffundál át. 20 ml 2. reagenssel - amely a hagyományos eljárásban 20 perc működési időnek megfelelően 20 meghatározáshoz elegendő - az eljárást 200 percen át folytatjuk. Eközben nem figyelhető meg az érzékenység (extinkció per 100 mg glükóz) csökkenése. Ezen idő alatt 96 vizes standardoldatot (50—400 mg glükóz per 100 ml) és 40 kontrollszérumot analizálunk változatlan pontossággal. A többi időt arra fordítjuk, hogy ellenőrizzük a reagensek alapextinkciójának állandóságát (= bázisvonal). Ezt az eljárást laktát-dehidrogenáz helyett azonos módon más dehidrogenázokkal is végrehajthatjuk. 3. példa Glükóz-meghatározás glükózoxidáz (GOD) — peroxidáz (POD) — módszenei a) A reagens visszanyerése nélküli módszer (enzim-körfolyamat nélkül) [Clinical Chemistry, 21. kötet, 12. sz. 1754—1760.0. (1975)] A meghatározás a következő reakcióegyenletek szerint folyik le: Glükóz + Oj £22 glükonsav + H202 POD HjOj + fenol + 4-aminofenazon----» kinoidális festve (az 1. példában ismertetettekkel analóg módon) A reagens összetétele: 0,1 M foszfát-puffer, pH = 6,5, 2 mM 4-amino-antipirin, glükóz-oxidáz (GOD) >10 E/ml, peroxidáz (POD) >1 E/ml és 10 mM fenol. A folyamatábra az 1. ábra szerinti. b) Találmány szerinti eljárás A következő reagenseket használjuk: 1. reagens: 0,4 M foszfát-puffer, pH = 6,5, glükóz-oxidáz >10 E/ml 2. reagens: 40 mM 4-amino-antipirin, 50 mM fenol. A folyamatábra a 2. ábrának felel meg. A színezék eltávolítására szolgáló faszénoszlopot az 1. példában ismertettek szerint alkalmazzuk. Az ismert eljárásnál 30 ml reagens alkalmazása megfelel 30 perces műveleti időnek (vagyis 30 meghatározásnak). A találmány szerinti eljárás során 600 percen át változatlan pontossággal elemeztünk sztandard-, illetve szérum-mintákat 20-as sorozatban, 5 (desztillált vizes) vakpróbával megszakítva, a bázisvonal állandóságának vizsgálatára. A vizsgálat során az enzimeket 20 alkalommal használtuk újra, vagyis az enzimek költségtényezője huszadrészére csökkent. A bázisvonal konstans maradt. 4. példa Húgysav meghatározása kataláz alkalmazásával AutoAnalyzerral Eljárás: 1. a dialízis előtti reakció: húgysav + 02 allantoin + H202, a hidrogén-peroxidot dializáljuk, 2. a dialízis utáni reakció: H202 + 2,4-diklórfenol + 4-amino-antipirin peroxidáz 4 Hj() + 4_N_(3,5-diklór-l,2-benzokinon-monoimino)-fenazon. A folyamatábrát az 5. ábra szemlélteti, ahol 1 minta (0,23 ml/min ) 2 1. sz. reagens (0,8 ml/min) 2 levegő (0,32 írd/min) 4 2. sz. reagens (0,8 ml/min) 5 levegő (0,32 ml/min) 6 dializátor 7 fotométer (520 nm) 8 reaktor 9 tömlőszivattyú 1. reagens: 0,05 M Trisz/HCl-puffer, pH = 83, urikáz 1 E/ml 2. reagens: 0,05 M Trisz/HG-puffer, pH = 8,0, 5 mM 2,4-diklórfenol, 1 mM 4-amino-antipirin, peroxidáz 1 E/ml 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
