172446. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1-[L-(-)-gamma-amino-alfa-hidroxi-butiril]-kanamicin A előállítására
21 172446 22 6’-Benziloxikarbonil-l,3,3”-tri-p-nitro-benzal-kanamicin A 5 9,0 g (14,5 mmól) 6’-Cbz-kanamicin A-t 500 ml abszolút etanolban 24 C°-on szuszpendálunk, és a szuszpenzióhoz 8,7945 g (58,2 mmól) p-nitrobenzaldehidet adunk. A keveréket visszafolyatással melegítjük, ezalatt a reakciókeverék tiszta, sárga színű 10 oldat lesz, de melegítés közben hamarosan fehér szilárd termék kezd képződni. A reakciókeveréket 3 órán át melegítjük visszafolyatással, majd lehűtjük, a terméket kiszűrjük, és kevés abszolút etanollal mossuk. A hozam 14,0 g (94,5%) fehér kris- 15 tályos termék, amelynek olvadáspontja 233-234 C° (nem korrigált). Az analízis a C47H51N7O19 összegképletre: Számított: C = 55,46%, H = 5,05%, 20 N = 9,63%, Talált: C = 55,39%, H=5,08%, N = 9,60%. 13, példa 14. példa l-N-[L-(—)-7-amino-a-hidroxi-butiril]-kanamicin A (I) 30 5,0 g (4,91 mmól) 6’-Cbz-l,3,3”-tri-p-nitro-benzal-kanamicin A terméket 50 ml dimetilformamidban 24C°-on feloldunk. 2,064g (5,895 mmól) L-(—)-7-benziloxikarbonilamino-a-hidroxi-vajsav N-hidroxi-szukcinimid-észterét 20 ml dimetilform- 35 amidban 24 C°-on feloldunk, és ezt az oldatot 75 perc alatt erélyes keverés közben az előzőleg készített oldathoz adjuk. Az oldatot éjszakán át 24 C°-on keverjük. Gőzsugárvákuumot használva az oldatot 40 C°-on szárazra pároljuk. Ezután metanollal (100 ml) ismételten bepároljuk, és így viszkózus olajat kapunk. Ezt az olajat dioxán-víz 1 : 1 keverékének 100 ml mennyiségében feloldjuk, és az oldathoz 10 ml jégecetet adunk. Az oldatot 500 ml-es Parr-palackba tesszük, hozzáadunk 2,5 g 5%-os PdIC (Engelhard) katalizátort, és 4 órán át 24 C°-on 3 atm hidrogénnyomáson redukáljuk. Ezalatt az idő alatt (a zárt palackban) a teljes nyomáscsökkenés 5,9 atm, beleértve az időszakos nyomásmentesítéseket. A keveréket diatomaföld-rétegen szűrjük, és 3 x 50 ml 50%-os vizes dioxánnal mossuk. Az egyesített szűrleteket szárazra pároljuk, n-butanollal (100 ml) azeotrop desztilláljuk, végül metanollal újra bepároljuk, és így viszkózus olajat kapunk. Az olajat 30 ml metanolban feloldjuk, majd erélyes keverés közben 1000 ml hideg (5—10 C°) dietiléterbe öntjük. A képződött szuszpenziót jégfürdőben 1/2 órán át keverjük, a csapadékot kiszűrjük, és foszforpentoxidot tartalmazó vákuumexszikkátorban azonnal szárítjuk. A termék súlya 4,9620 g. A vékonyrétegkromatogram szerint a termék főleg az I képletű vegyületből és kanamicin A-ból áll és nyomokban tartalmaz di- és triszubsztituált kanamicin A vegyületet, továbbá 4-amino-2-hidroxi-vaj savat. A különböző frakciókat 40 x 100 mm nagyságú, Amberlite IRC—50 (NH4+ forma, I típus, 100/200 szemcsenagyság) gyantát tartalmazó 980 mm hosszúságnak megfelelő gyantaágyon szétválasztjuk. 4,600 g nyers keveréket 1 ml vízben oldva oszlopra viszünk, az oszlopot víz-2 n ammóniumhidroxidoldat grádiensű oldószerrel eluáljuk, és az eluátumot 15 ml-es frakciókra bontjuk. 295 frakciót gyűjtünk össze, majd az oszlopot 1,5 liter 3n ammóniumhidroxiddal mossuk. A frakciókat az optikai forgatóképességük alapján egyesítjük, és a szilárd termékeket liofilezéssel elkülönítjük. Frakció száma összetétel Súly g Súlykorrekció a nyers termékből, g Biovizsgálat Hozam '/ 120-150 kana A 1,1654 1,257 809 42,6 201-224 BB-K29 0,40 0,43-228-241 BB-K8 0,6523 0,7036 786±101x 19,2XX x 4 Petri csésze átlagértéke, ± standard tűrés ^ ha beszámítjuk a visszakapott kanamicin A-t, akkor az átalakulás BB-K8 (I) termékké 33,5%. Ebben az eljárásban a BB-K8/kanamicin A arány 0,45. Az analízis a C22H43N50i 32H2C03 összegképletre: 60 Számított: C = 40,62%, Az eljárás során kapott I képletű vegyület ol- N = 9,87%, vadópontja: 194 C° (bomlással), [aJo1: +85° (c = 2, Talált: C =40,21%, víz). B. subtilis mikroorganizmusra vizsgálva (agar N = 9,37%, korongon) a relatív potencia 960 Mg/mg (standard: C = 39,79%, kanamicin A szabad bázis). 65 N = 9,49%. H =6,68%, H =6,96%, H = 6,87%, 11
