172238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavicepaminok előállítására
3 172238 4 konyhasóoldattal történt, a levett eluátumok fehérjetartalmát Lowry módszerrel [J. Biol. Chem. 193, 265 (1951)] határoztuk meg (1. ábra). A kapott csúcsok alapján az eluátumokat kilenc frakcióba egyesítettük és ezek acetonnal kicsapott termékeit (a továbbiakban: klavicepamin 1—9. frakció) fehérje-analitikai módszerekkel vizsgáltuk. A kapott eredményeket az I—III. táblázat tartalmazza. A táblázatokban a klavicepamin 1—9. frakció poliakrilamid gél-elektroforetikus mozgékonyságát, aminosav összetételét és átlagos molekulasúlyát mutatjuk be. A molekulasúly számításához a 2. ábra szerinti kalibrációs görbét használtuk. A kísérleti módszerek részleteit az 1. példa tartalmazza. A vizsgálatok alapján kitűnik, hogy a Claviceps tenyészetben lizin halmozódik fel 3500—18 000 molekulasúlyú’ kopolimerek formájában. A lizint kísérő aminosavak között nincs kiemelkedően jellemző, szemben az fi hiszton alanin tartalmával. Meglepő újdonság a molekulasúly csökkenésével emelkedő magas, 90%-ot meghaladó lizintartalom, továbbá az is, hogy a beépülő argininek egy része mindig metilezett alakban (mint N6-mono-, vagy N6,N6-, vagy N6,N6-dimetil-arginin) van jelen. A találmány szerinti új vegyületcsoport előállítására felhasználhatjuk a Claviceps fajok, így a Claviceps purpurea, a Claviceps paspali, a Claviceps fusiformis stb. bármely parazita, vagy szaprofita tenyészetét, azaz az anyarozs drogot, a mesterséges táptalajon történő felületi, vagy süllyesztett tenyésztések anyagát. A klavicepaminok találmány szerinti előállításának iparilag is megvalósítható módja a Claviceps fajok süllyesztett tenyésztése, majd a fermentációs szaporítás során nyert fermentlevek feldolgozása. A süllyesztett tenyészetben képződő klavicepamin jelentős hányada a sejtmentes szűrletben található. Ez a körülmény lényegesen megkönnyíti a feldolgozást, egyben lehetőséget ad arra, hogy a kinyerés első lépésében a klavicepamint a sejtben levő fehérjéktől elválasszuk. A találmány tárgya eljárás a Claviceps fajok által termelt, 3500—18 000 molekulasúlyú, lizinben gazdag bázikus fehérje-elegy, azaz klavicepamin-elegy és adott esetben az elegy egy vagy több komponense, a klavicepamin 16 900—18 000 molekulasúlyú 1., 15 200—16 900 molekulasúlyú 2., 13 500—15 200 molekulasúlyú 3., 11 800—13 500 molekulasúlyú 4., 10 200—11 800 molekulasúlyú 5., 9000—10 200 molekulasúlyú 6., 7000— 9000 molekulasúlyú 7., 5600—7000 molekulasúlyú 8., és/vagy 3500—5600 molekulasúlyú 9. frakció előállítására oly módon, hogy a Claviceps purpurea MNG 22/1964 vagy MNG 56/1970 törzs vagy a Claviceps fusiformis MNG 68/1971 törzs szűrt fennen tie véből vagy az említett törzs micéliumának vagy szkleróciumának vagy a lizergsavamidot termelő Claviceps paspali ATCC 13 892, ATCC 13 893, ATCC 13 894 vagy ATCC 13 895 törzs szkleróciumának adott esetben valamely szerves oldószerrel végzett zsírmentesítés után készített vizes, vizes sav-oldatos, vizes só-oldatos vagy alkoholos extraktumából a klavicepamin-elegyet és a nagy molekulasúlyú kísérőanyagokat valamely szerves oldószerrel, valamely szervetlen sóval vagy triklórecetsavval kicsapjuk, a csapadékot előnyösen szűréssel elválasztjuk, majd a klavicepamin-elegyet ionszegény vízzel, híg vizes só-oldattal vagy foszfát-puffer-oldattal szelektíven kioldjuk, az oldatból valamely fehérjekomplex-képző oldat, előnyösen vizes Reinecke-só oldat vagy valamely szerves oldószer, előnyösen etanol hozzáadásával kicsapjuk, a csapadékot elválasztjuk és adott esetben tovább tisztítjuk és adott esetben az elegyet frakciókra bontjuk. A fermentlé szűrletét felhasználva a találmány szerinti eljárás foganatosításánál oly módon járunk el, hogy a bázikus fehérjéket szerves oldószerrel, triklórecetsavval kicsapjuk, vagy szervetlen sóval kisózzuk. Szerves oldószerként felhasználhatók például kis szénatomszámú alkoholok, aceton, dioxán, klórozott szénhidrogének. Kisózásra alkalmazhatunk például ammóniumszulfátot, nátriumkloridot. A kapott leválasztott és megszárított csapadékot az egyéb nagy molekulasúlyú szennyezésektől, például poliszacharidoktól tisztítjuk, amikoris azt fehérjetartalmára számított kis mennyiségű — 5—20- szoros térfogatú — desztillált vízben oldjuk, a nem oldódó részt elvetjük, és az oldatból a bázikus fehérjéket ismételten kicsapjuk. Oldószeres kezelést követően célszerűen a második lecsapásnál anionos lecsapószert, például Reinecke-sót alkalmazunk, a kisózással történő kinyerést követően pedig a vizes oldatot kezelhetjük alkohollal. így a bázikus fehérjéket, a klavicepaminokat tartalmazó termékhez jutunk. A termék összetevői hatásvizsgálatok céljaira frakciókra bonthatók, gélfiltrációs, kromatográfiás, frakcionált kicsapásos módszerekkel. Gélfiltrációt dextrángéleken (például Sephadex, DEAE-Sephadex, Molselect), akrilamid alapú géleken (pl. Bio-Gel, Akrilex) végezzük desztillált vizes, sósvizes, foszfát-pufferes, vagy illő pufferes (például ammóniumformiát) kifejlesztéssel. A kromatográfiás elválasztást (például DEAE cellulóz oszlopon, alumíniumoxid oszlopon) végezhetjük a fenti eluálószerek valamelyikével. Ezekben az esetekben a frakciókat a fehérjetartalom meghatározása alapján gyűjtjük és egyesítjük. A kívánt terméket tartalmazó frakcióból a klavicepaminokat közvetlenül, vagy sós közeg esetén sómentesítés után liofiíezéssel nyerjük ki. Frakcionált kicsapást végezhetünk 3—4 lépésben növekvő koncentrációjú (10—50%) ammóniumszulfáttal, vagy 5—12-szeres mennyiségű acetonnal. A frakciókból a kívánt terméket tartalmazókat kiválasztva, szűrve, szárítva, só- és oldószermentesítve közvetlenül is felhasználhatjuk, vagy a fenti elválasztási módszerek valamelyikével az előfrakcionált anyagot molekulasúly szerint, ill. bázikusság szerint finomabb frakcionálásnak vethetjük alá. Hasonlóan: molekulasúly szerint egységesebb végtermékhezjuthatunk ultrafiltrációs izolálással. I A vázolt termékkinyerés során az esetek többségében már a fermentléből leválasztott első csapadék, de valamennyi esetben a bázikus fehérjékre dúsított csapadék állati szervezetben előidézett tumorok növekedésének gátlására volt képes. Ilyen vizsgálatok történtek subeutan Yoshida patkány sarcoma, NK/Ly ascites tumor, Ehrlich ascites tumor fejlődését vizsgáló módszerekkel. A gátlás határozottan kimutatható volt minden olyan esetben, amikor a vizsgált minta átlagos lizintartalma meghaladta a 40 mól%-ot. A tisztított klavicepamin preparátumok 10—100 mg/kg dózisban 5—10 napon át adagolva 40—100% gátlást fejtettek ki. A bemutatott modellkísérlet csoportosított frakciói nagyságrendi eltérést biológiai aktivitásban nem mutattak, e szerint a klavicepamin 3500—18 000 molekulasúlyú és a 32—93% lizintartalom tartományban biológiailag aktív, sejtproliferációt gátló termék. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
